盐析沉淀蛋白质时.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 蛋白质的通性、纯化与表征,1,、蛋白质的理化性质：,酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应,2,、分离纯化的方法：,盐析、电泳、等电聚焦、层析等,3,、表征：,活力、比活力,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。,在等电点时,，,蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,在不同的,pH,环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。,这种现象称为蛋白质电泳,1,、酸碱性质,COOH,NH,COO,NH,COO,NH,阳离子,PHPI,兼性离子,PH=PI,OH,OH,可,解离基团有末端和侧链,故,p,I,与酸性、碱性氨基酸的数目有关,如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性,有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定,没有盐类干扰时的等电点叫,等离子点,蛋白质分子的颗粒直径已达,1-100nm,，,处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2,、蛋白质的胶体性质：,蛋白质的胶体性质,布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力,蛋白质溶液稳定的原因：,1,）表面形成水膜（水化层）；,2,）带相同电荷。,3),大小为,1-100nm,的胶体颗粒,+,+,+,+,+,+,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。,改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质,在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,蛋白质的沉淀作用,加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。,分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（,50%(NH,4,),2,SO,4,饱和度），清蛋白（饱和,(NH,4,),2,SO,4,),。,2.,加有机溶剂,加重金属盐,加生物碱试剂,单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。,在温和条件下，通过改变溶液的,pH,或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。,在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和,条件,有机溶剂沉淀法,等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。,由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。,如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。,二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。,蛋白质的变性,三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。,四、加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为,凝固,。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,反应名称,试 剂,颜色,反应有关基团,有此反应的蛋白质或氨基酸,双缩脲反应,NaOH,、,CuSO,2,紫色或粉红色,二个以上肽键,所有蛋白质,米伦反应,HgNO,3,、,Hg(NO,3,),2,及,HNO,3,混合物,红色,Tyr,黄色反应,浓HNO,3,及NH,3,黄色、橘色,Tyr,、,Phe,乙醛酸反应,(,Hopking,-Cole,反应,),乙醛酸试剂及浓,H,2,SO,4,紫色,Trp,坂口反应,(,Sakaguchi,反应,),-,萘酚、,NaClO,红色,胍基,Arg,酚试剂反应,(,Folin-Cioculteu,反应,),碱性,CuSO,4,及磷钨酸,-,钼酸,蓝色,酚基、吲哚基,Tyr,茚三酮反应,茚三酮,蓝色,自由氨基及羧基,-,氨基酸,4,、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量,OH,N,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。,这三种氨基酸的在,280nm,附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在,280nm,附近显示强的吸收。,利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色,5,、蛋白质的紫外吸收,分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度,依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性,若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整,难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）,蛋白质的分离与纯化方法,（一）盐析与有机溶剂沉淀：,盐溶,盐析：,在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为,盐析,。,常用的中性盐有：,硫酸铵,、氯化钠、硫酸钠等。,盐析时，溶液的,pH,在蛋白质的等电点处效果最好。,盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。,分段盐析：,半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白,。,2.,有机溶剂沉淀蛋白质：,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。,沉淀原理是：,脱水作用；,使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,（二）电泳：,带电粒子在电场中移动的现象称为,电泳（,electrophoresis),蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带,电荷量,不同，且,分子大小,也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。,电泳,蛋白质在等电点,pH,条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。,2.,区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。,（,1,）纸上电泳：用滤纸作支持物。,（,2,）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,（,3,）双向电泳,4,）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。,+,5,）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,-,+,两种凝胶电泳,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶,+,+,+,5.0,6.0,7.0,稳定,pH,梯度,5.0,6.0,7.0,稳定,pH,梯度,通电,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,SDSPAGE,中,SDS,的作用：,阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态,屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷,使得蛋白质的形状趋于一致,所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋白质的大小（分子量）,（三）层析：,层析（,chromatography),是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的,分布不同,而进行分离分析的技术方法。,主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及,亲和层析、,HPLC,等。,凝胶过滤分离蛋白质,（四）超速离心：,利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。,超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数,S,成正比。,蛋白质相对分子量在,10 000-1 000,000,之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、,超离心法,、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,最准确可靠的方法是,超离心法,（,Svedberg,于,1940,年设计）：蛋白质颗粒在,25-50*10,4,g,离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（,s,）：,单位（,cm,）,离心场里的沉降速度。,s,=,v,2,x,v,=,沉降速度（,dx/dt,）,=,离心机转子角速度（弧度,/s,）,x,=,蛋白质界面中点与转子中心的距离（,cm,）,沉降系数的单位常用,S,，,1S=110,-13,（,s,）,蛋白质分子量（,M,）与,沉降系数（,s,）,的关系,M,=,RTs,D,（,1V,）,R,气体常数（,8.31410,7,ergsmol,-1,度,-1,）,T,绝对温度,D,扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）,V,蛋白质的微分比容（,m,3,g,-1,）,溶剂密度（,20,，,gml,-1,）,s,沉降系数,酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率,酶（活力）单位,：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（,U/g,，,U/ml,）,在最适的反应条件（,25,）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即,1IU=1mol/min,在,最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为,1kat,单位，即,1kat=1mol/s,1kat=610,7,IU,蛋白质的表征,酶的纯度,：,比活力,=,活力单位数,/,毫克蛋白（氮）,纯化倍数,=,每次比活力,第一次比活力,产率,%,（回收率）,=100,每次总活力,第一次总活力,酶的纯化鉴定,：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法,