实时定量PCR简介.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Real-time Quantity PCR,NJSunshine,李文,2005.11.17,实时定量,PCR,简介,定量,PCR,是在,PCR,定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量,PCR,技术是一种在,PCR,反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对,DNA,模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点,。,实时定量,PCR,的两个重要概念,（1）荧光域值（,threshold）：,以,PCR,反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。,(2),Ct,值：也称循环阈值，,C,代表,Cycle，t,代表,threshold。,指在,PCR,循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻,可见,Ct,值取决于阈值。,经数学证明，,Ct,值与模板,DNA,的起始拷贝数（,dRn,）,成反比,。,作用原理,实时荧光定量,PCR,常用的检测模式五种：,（,1）,TaqMan,探针,（2）SYBRGreen,（3）,LUX,引物,(4),Molecular beacon,(5),荧光谐震能量传递（,FRET,Roche product,）,SYBRGREEN,FRET,探针,Taqman,分子信标,LUX,引物,性质,可逆荧光,积累荧光,熔点分析,能,不能,特异性,引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）,引物2探针,引物探针,引物探针,引物（非特异性扩增或引物二聚体无影响）,探针,不需要,需要,需要,需要,不需要,通用性,通用,专用,专用,专用,专用,1.,TaqMan,探针方法的作用原理:,本方法的原理主要是利用,Taq,酶的53外切核酸酶活性并在,PCR,过程中反应体系加入一个荧光标记探针。,TaqMan,探针5端标以荧光发射基团，3端标以荧光猝灭基团。该探针在,PCR,过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3端猝灭基团抑制5发射基团的荧光发射。在,PCR,的退火期。探针与引物所包含序列内的,DNA,模板发生特异性杂交。延伸期引物在,Taq,酶作用下延,DNA,模板延伸，当到达探针处，,Taq,酶发辉53外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和,PCR,产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50150,bp,。,探针设计一般应符合以下条件：,(1),GC,碱基含量在40%-60%。,（2）避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是,G。,（3）,避免5端为,G，,因为,G,对荧光可能有抑制作用，尽量使,C,个数多于,G。,（4）,长度应在15-25个碱基左右，以保证结合的特异性。,（5）探针的,Tm,值要比引物的,Tm,值至少高出约10。,另外，探针与引物不能形成二聚体，位置与上游引物尽量接近但不要重叠。,(2),SYBRGreenI,荧光染料的作用原理,SYBRGreenI,是一种只与双链,DNA,小沟结合的染料，当它与,DNA,双链结合时，发出荧光；从,DNA,双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链,DNA,分子的数量。它的缺点是在于能与非特异性双链,DNA（,如引物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。,这种检测方法无法应用于多重,qPCR,中,(3)LUX,引物,LUX(light upon,extention,),引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作。引物对中的一个引物,3,端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用,LUX,引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。,Invitrogen,可以提供5中荧光标记：,FAM,JOE,HEX,TET and,Alexa,Flour 546。,图.,LUX,引物工作原理,Lux,引物,LUX,TM,技术的优势,1.通过,LUX,TM,Primer,服务中心联系，由专家给您设计适合您实验的新的引物。,Invitrogen,qPCR,产品,(1),superscript RT,可获得更高的,cDNA,产量和更好的特异性。,(2),Platinum,Taq,DNA,Polymerse,为,PCR,反应提供更高的特异性和产量。,(3),Supermixes,包括了,Platinum,Taq,DNA,聚合酶和,UDG,及,dNTPs,，ROX,参照染料。,(4)SYBR Green,及,LUX,引物,qPCR,试剂盒,1.一步法,(1)优化于,ABI,系统,SuperScript,Platinum one-step,qRT,-PCR Kit w/ROX,SuperScript,Platinum SYBR Green one-step,qRT,-PCR Kit w/ROX,(2),适用于其他系统,Superscript,Platinum one-step,qRT,-PCR Kit,SuperScript,Platinum SYBR Green one-step,qRT,-PCR Kit,(3)RNA,UltraSense,One-step Quantitative RT-PCR System,适用于超低量,RNA,摸板的灵敏扩增的,QRT-PCR,系统,(4),Platinum,qRT,-PCR,Thermoscript,One-step System,适用于扩增具有二级结构的,RNA,2.二步法,(1,),优化于,ABI,系统,SuperScript,Platinum two-step,qRT,-PCR Kit w/ROX,SuperScript,Platinum SYBR Green two-step,qRT,-PCR Kit w/ROX,(2)适合于其他系统,Superscript,Platinum one-step,qRT,-PCR Kit,SuperScript,Platinum SYBR Green one-step,qRT,-PCR Kit,(3),Superscript,Platinum,CellsDirect,二步法,Superscript,Platinum,CellsDirect,Two-step,qRT,-PCR Kit,SuperScript,Platinum,CellsDirect,Two-step,qRT,-PCR Kit w/SYBR Green,3.,SuperScript,1st,cDNA,合成系统,SuperScript,First-Strand Synthesis,superMix,for,qRT,-PCR,