高效液相色谱法讲义_72页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 高效液相色谱法,第一节 概述,一、史程、专用术语,二、色谱分离过程和类型,液固吸附色谱,液液,分配色谱,离子交换色谱,离子对色谱,空间排阻色谱,,/,三、色谱流程和仪器,四、,HPLC,的特点,速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用,第二节 基本理论,一、色谱分离过程,（,一）液,-,固吸附色谱,流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸,附作用的不同来分离物质。,流动相和固定相都是液体的色谱法即为液,-,液,色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间,的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一,种是涂渍于载体上的固定相。,（二）液,-,液分配色谱,流动相极性小于固定相极性的液,-,液色谱法称为正相,分配色谱法,流动相极性大于固定相极性的液,-,液色谱法称为反相,分配色谱法,（,三）离子交换色谱,（,四）离子对色谱法,（,五）分子排阻色谱法,二、色谱流出曲线和保留值,（,一）色谱流出曲线及相关术语,（,二）保留值,三、分离度,第三节 定性和定量分析,一、定性分析,（,一）利用已知物对照法定性,1,、利用保留特性,2,、利用不同柱比较,（,二）色谱法和其他方法结合定性,1,、利用化学反应定性,2,、利用二极管陈列检测器,3,、收集峰的流出物,4,、,HPLC-MS,二、定量分析,（,一）峰面积或峰高的测量方法,1,、手测峰高,2,、峰高乘半峰宽,3,、剪纸称重,4,、积分仪测定,5,、微处理机测定,（,二）定量方法,1,、峰面积归一法,2,、外标法,3,、内标法,4,、内加法（或追加法）,第四节 高效液相色谱的分离模式,一、基本原理,二、分类,1,、吸附色谱,2,、分配色谱,3,、离子交换色谱,4,、分子排阻色谱,5,、亲和色谱,三、,HPLC,在生物大分子中的应用,在,生物大分子中的,HPLC,中，,体积排阻色谱,，,离,子交换,、,反相液相和亲和色谱,是最常用的分离,模式。,第五节 液,-,固色谱法,液,-,固色谱法通常称为吸附色谱,1,、载体：硅胶,2,、吸附剂吸附试样的能力,3,、原理,第六节 键合相色谱法,一、正相色谱法,1,、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团,都是极性基团。,2,、分离机制属于分配色谱,3,、主要用于分离极性不同的化合物，特别是,用来分离不同类型的化合物。,二、反相色谱,1,、分离机理,2,、固定相,3,、流动相,第七节 离子交换色谱,离子交换色谱是以,离子交换树脂,作为固定相，,树脂上具有,固定离子基团,及,可交换的离子基团,，,当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，,组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交,换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。,按结合的基团不同，离子交换树脂可分为,阳离子,交换树脂,和,阴离子交换树脂,。,种类,阳离子交换树脂,强酸性,弱酸性,阴离子交换树脂,强碱性,弱碱性,离子交换层析适用性,能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。,使用离子交换剂使物质分离表,样品,强酸型,(,磺酸型,),稀,NH,4,OH,洗脱,通过液,酸性、中性化合物 解离型、两性化合物,稀,NaOH,洗脱,强碱型,(,季铵型,),强碱型,稀,HCl,洗脱,通过液,通过液,酸性化合物 中性化合物 解离型物质 两性化合物,(,盐、生物碱,),一、离子交换色谱的分离机理,1,、,不足之处,：忽略了在填料表面上形成复合物时,溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置,换反应的重要因素。,2,、,P,0,：,流动相中溶质的浓度,P,b,：,填料表面上被吸附的溶质浓度,D,0,：,流动相中洗脱剂的浓度,D,b,：,填料表面上洗脱剂的浓度,Z,：,是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的,洗脱剂的数目,。,Z,可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数,在,Z,值不能忽略时,在,等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子,K,与保留,体积成比例，同时洗脱过程中，,K,d,，,D,b,是常数，,用,K,z,表示。,3,结论,二、离子交换色谱的固定相,1,、高分子类型填料,优点,a,填料的使用寿命长,b,具有较高的色谱容量,c,很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性,有利。,结构,以交联共聚的苯乙烯,-,二乙烯苯为基质，同时,也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。,类型,Mono Beads,TSK-gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW,2,、无机基质型,三,、,离子交换色谱的流动相,1,、流动相的,PH,值,离子交换容量受,流动相的,PH,值影响,改变流动相,PH,值，也会影响弱电离的酸,性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的,保留值。,流动相,PH,值的,变化也能改变分离的选择性,对流动相,PH,值的,控制，通常采用缓冲溶液,来实现。,2,、流动相的离子强度,四、离子交换色谱的影响因素,1,、填料孔径的影响,2,、柱长的影响,3,、流速的影响,4,、,PH,值的影响,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质,均显示不同,PH,值影响结果，因此决定了它的保,留选择性、分离度和回收率等因素。,5,、离子强度的影响,第八节 体积排阻色谱法,一、分离机理,1,、,体积排阻色谱法（,SEC,）,或空间排阻色谱法（,SEC,）,或凝胶色谱法,2,、,凝胶过滤色谱法（,GFC,）,Sephadex,葡聚糖凝胶,3,、,凝胶渗透色谱法（,GPC,）,4,、空间排斥理论,V,0,死体积，相当于凝胶的粒间体积,V,s,色谱柱中凝胶的孔穴总体积,二、体积排阻色谱法的特点,三、体积排阻色谱法的固定相,（,一）,固定相的分类,1,、按固定相基质分类,2,、按固定相机械强度分类,（,二）凝胶固定相的特性参数,1,、渗透极限,2,、分离范围,3,、固流相比,在,SEC,中常将柱中,凝胶孔体积,中的溶剂称为,固定相,，而将柱中,凝胶颗粒间空隙体积,中称为,流动相,，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积,的比值称作固流相比。,4,、柱效,（三）,凝胶色谱柱的制备及谱图的特点,物理因素,影响凝胶色谱柱的性能,扩大分离范围,使用两根以上的串联色谱,柱,。,更换流动相,谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量,聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。,在低效排租色谱法，样品分子大小随,V,的增加,而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增,大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度,保持不变。,在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。,四、体积排租色谱法的流动相,在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值,和分离选择性无影响。,溶解样品的良溶剂,低黏度溶剂,柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀,控制流动相的,PH,值和,离子强度,凝胶渗透色谱,示差折光检测器,流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率,有较大的差别。,凝胶过滤色谱,紫外吸收检测器,使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。,（,一）凝胶渗透色谱的流动相,凝胶渗透色谱常采用,甲苯，四氢呋喃和氯仿,等,有机溶剂作流动相。,在,用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，,四氢呋喃,是最常用的流动相，它对样品有良好,的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。,（二）凝胶过滤色谱的流动相,在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同,PH,值的多种缓冲溶液作流动相。,五,、,体积排租色谱的影响因素,1,、填料,化学键合的硅胶,亲水树脂凝胶,2,、柱长,体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。,3,、洗脱液,以硅胶为基质的填料，,PH,值范围在,2.0-8.0,。,键合硅胶如,TSK,系列凝胶柱在分离蛋白质时,保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离,子的反应。,a),洗脱液离子强度低时,b),洗脱液离子强度低增加到,0.3-0.5mol/L,c),常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节,d),用氯化钠作离子剂，疏水作用最小,e)PH,值不能太低，因为,H,+,会腐蚀不锈钢柱,4,、流速,蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很,重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比,较理想。,5,、样品容量,进样,体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的,分离度。,样品的浓度范围一般在,0.01%-0.5%.,最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得,到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积,的,1%-3%,比较合适。,6,、蛋白质在变性条件下的分离,变性溶剂如,6mol/L,盐酸胍,、,8mol/L,脲,、,0.1%,十二烷基硫酸钠,(SDS),等有助于精确地确定蛋白,质的分子量。,在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到,低分子量范围内。,示例：用高效凝胶过滤色谱法,(HPGFC),测定重组,人肿瘤坏死因子,(,rh,-TNF),衍生物的相对分子量,rh,-TNF,属,基因工程药物，其相对分子量的测定,是该药质量控制的主要指标之一。,仪器与色谱条件：岛津,LC-10A HPLC,色谱柱：,Beckman,Ultraspherogel,SEC 3000,(30cm7.5cm),流动相,0.1mmol/L KH,2,PO,4,:0.1mmol/L Na,2,SO,4,(1:1)+0.05%NaN,3,流速,:1mL/min,检测波长,:280nm,标准蛋白相对分子量曲线的制备,：,选用四种蛋白：,醛缩酶,、,血清白蛋白,、,碳酸酐,酶,及,抑蛋白酶肽,制成的混合标样。考虑流速等,因素对保留时间,T,的影响而选用了,内标法,、既,在混合标样中加入,右旋糖酐蓝,和,酪氨酸,作为内,标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填,料孔的两种内标的保留时间,T,0,和,T,t,，,用分配系,数,K,d,对相对分子量对数作图，从而保证结果有,良好的重现性。,样品测定,:,根据样品的保留时间,T,求出其分配系数,K,d,，由,K,d,从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的,lgM,r,，,计算相对分子质量。,第九节 亲合色谱法,亲合,色谱法是利用或模拟生物分子之间的专,一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特,殊物质的一种色谱方法。,亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键,形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择,性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统,亲合色谱的,专一性,与,HPLC,的,快速,，,稳定,，,检测,方便,等优点结合起来。,一、亲合色谱分离机理,亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体,的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。,亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合,复合物形成及其解离的过程。,载体,L,X,配基,待,分离物质,通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的,组分洗脱下来：,a),如果亲合复合物的亲合力不强,b),当配基与被,分离组分的亲合力较强,c),非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱,配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合,复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低，,也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。,R,：,结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力,K,：,复合物的离解常数,L,：,固定化配基的浓度,二、亲合色谱的固定相,亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生,物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如,果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，,就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基,相对应的物质。,1,、有机高分子类：多孔的硬质凝胶,交联聚,苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性,等树脂。,优点,具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，,广泛的,PH,值的适应性,对于生物大分子样品都有较好的相溶性。,填料容易合成,2,、无机基质,多孔硅胶,可,控,孔径玻璃,3,、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱,的特点,可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和,浓度,检测灵敏度得以大幅度提高,具有更高的选择性,配,基,结合的牢固性也可以延长填料的寿命并,提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化,工作是非常有利。,三、亲合色谱影响因素,1,、平衡和平衡缓冲溶液,选择平衡缓冲溶液所具有的,PH,值,，,离子强度,，,温度,和,化学组成,都应使配体与蛋白质之间能发,生比较强的相互作用。,2,、蛋白质的浓度和温度效应,对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓,度对亲合容量的影响不明显，柱顶端结合的大分,子与最初加入的大分子浓度无关。,温度效应在亲合色谱中非常重要，因为亲合,填料吸附作用的强度随温度升高而降低。,3,、特异性洗脱,通常选用对纯化的活性分子有高的亲合力，但,其结构与填料上的配体不同的配体来洗脱，这,样就保证了吸附和洗脱双重特异性，使非特异,性洗脱减少到最小程度。,4,、非特异性洗脱,非特异性洗脱主要受缓冲溶液中的,PH,值，离子,强度，温度和介电常数的控制。,第十节 色谱分离方法的选择,一、相对分子量,分子量,2000,，凝胶色谱柱,分子量,2000,，但同时分子量相差,10%,，,凝胶色谱柱,分子量,2000,的水溶性电解质，酸性物质用,阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂,分子量,2000,的水溶性非电解质，选用反相,色谱法,分子量,2000,的非水溶性物质，弱极性物质,选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。,二、溶解度,水溶性,样品,离子交换色谱或液,-,液分配色谱,微溶于,水，但在酸或,碱存在下能很好离心,的化合物,离子交换色谱,油性样品,液,-,固色谱法,相对非极性化合物,液,-,固色谱法,三、化学结构,结构特点,分离方法,离子型化合物,离子交换色谱，空间排阻和液,-,液分配色谱,异构体,液,-,固色谱法,同系物,液,-,液分配色谱,高分子聚合物,空间排阻色谱法,