核苷酸和核酸ppt.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,核苷酸和核酸ppt,核苷酸和核酸ppt,第1页,核 酸,(nucleic acid),是以核苷酸为基础组成单位生物大 分子，携带和传递遗传信息。,是生物体内一类含有磷酸基团主要生物大分子，担负着生命信息储存与传递。,是当代生物化学、分子生物学主要研究领域，是基因工程操作关键分子。,核苷酸和核酸ppt,第2页,本章教学目标要求,1.,掌握：,（,1,）,DNA,二级结构特点,（,2,）,mRNA,和,tRNA,结构特征及主要功效,2,熟悉：,（,1,）,DNA,三级结构：核小体结构特点,（,2,）,DNA,理化性质及其与结构关系,3.,了解：,（,1,）核苷酸分子组成、连接方式及书写方式；,（,2,）核酸酶,核苷酸和核酸ppt,第3页,重点：,掌握核酸构件分子结构特点、代 号；掌握,DNA,二级结构特点、稳定力、三级结构特点及相关概念；掌握,RNA,二级结构特点、类型；了解核酸主要理化性质。,难点：,构件分子结构特点，,DNA,二级结构关键点及三级结构相关概念，,tRNA,二级结构特点、真核生物,mRNA,二级结构特点，核酸理化性质中包括概念及应用。,本章重点及难点,核苷酸和核酸ppt,第4页,第一节 概 述,染色体、基因和,DNA,核酸化学组成,核苷酸和核酸ppt,第5页,一、染色体、基因和,DNA,染色体和基因,遗传基础单位,核酸,遗传信息载体,核苷酸和核酸ppt,第6页,怎样证实核酸是遗传物质载体？,年,O.T.Avery,细菌转化,试验是取得,DNA,携带遗传信息第一个证实；,年,Alfred D.,和,Hershey,等人建立,T,2,噬菌体捣碎试验，这是第二个证据，证实噬菌体复制物质是,DNA,而不是蛋白质外壳；,1953,年,Watson,和,Crick,DNA,双螺旋模型发觉，更深入揭示了,DNA,作为遗传物质储存和信息传递化学机制；,核酶发觉，一些核酸本身含有酶催化活性。,核苷酸和核酸ppt,第7页,1944,年，,Avery,转换转化试验,or,and,可分离,核苷酸和核酸ppt,第8页,二、核酸化学组成,元素组成,C,、,H,、,O,、,N,、,P,（,910%,）,分子组成,碱基,(base),：嘌呤碱，嘧啶碱,戊糖,(ribose),：核糖，脱氧核糖,磷酸,(phosphate),核苷酸和核酸ppt,第9页,1.,分类,核酸分为,RNA,和,DNA,核糖核酸,（,RNA,）：,脱氧核糖核酸,（,DNA,）：,m RNA,（信使,RNA,）,5,%,Pr,合成直接模板,t RNA,（转运,RNA,）,15,%,转运,Aa,r RNA,（核蛋白体,RNA,）,80,%,充当装配机，提供场所,细胞质，,参加蛋白质生物合成。,核内染色质，遗传物质基础，,决定遗传特征。,基因,DNA,分子中,功效,片段。,核苷酸和核酸ppt,第10页,组成核酸戊糖有两种。,DNA,所含糖为,-D-2-,脱氧核糖；,RNA,所含糖则为,-D-,核糖。,Ribose,Deoxyribose,2.,核酸中糖,戊糖,核苷酸和核酸ppt,第11页,嘌呤,(purine),腺嘌呤,(adenine,A),鸟嘌呤,(guanine,G),3.,含氮碱基,嘌呤和嘧啶衍生物,核苷酸和核酸ppt,第12页,嘧啶,(pyrimidine),胞嘧啶,(cytosine,C),尿嘧啶,(uracil,U),胸腺嘧啶,(thymine,T),核苷酸和核酸ppt,第13页,核苷：,AR,GR,UR,CR,脱氧核苷：,dAR,dGR,dTR,dCR,（,1,）碱基与戊糖连接,碱基和核糖（脱氧核糖）经过,糖苷键,连接形成核苷（脱氧核苷）嘧啶环,N1,（嘌呤环,N9,）与（脱氧）核糖,C1,。,1,1,4.,核苷酸,核酸基础结构单位,核苷酸和核酸ppt,第14页,核苷酸：,AMP,GMP,UMP,CMP,脱氧核苷酸：,dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,（,2,）核苷酸种类,核苷（脱氧核苷）和磷酸以,磷酸酯键,连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,核苷酸和核酸ppt,第15页,5.,核苷酸衍生物,含核苷酸生物活性物质：,NAD,+,、,NADP,+,、,CoA-SH,、,FAD,等都含有,AMP,多磷酸核苷酸：,NMP,，,NDP,，,NTP,环化核苷酸,:,cAMP,，,cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,NADP,+,NAD,+,核苷酸和核酸ppt,第16页,6.,核苷酸主要作用,核苷酸是合成,DNA,和,RNA,前体；,UDPG,、,CDP-,甘油二酯、,S,-,腺苷甲硫氨酸参加多糖、磷脂和卵磷脂生物合成,ATP,是生物体内生物能生成、储备、转运中心；,各种代谢反应中所需,NADH,、,HSCoA,、,FAD,、都是腺苷酸衍生物,cAMP,在生物体内含有传递信息作用,GTP,是生物大分子移位反应主要动力起源,核苷酸和核酸ppt,第17页,第二节 核酸结构,核苷酸和核酸ppt,第18页,一、核酸一级结构,定义,核酸一级结构是指核苷酸排列次序，包含核苷酸之间连接键。,因为核苷酸间差异主要是碱基不一样，所以也称为,碱基序列,。,5,端,3,端,C,G,A,核苷酸和核酸ppt,第19页,1.,磷酸二酯键,核苷酸之间基础连接,多聚核苷酸是经过一个核苷酸,3,-,醇羟基与另一个核苷酸,5,-,磷酸基形成,3,5,-,磷酸二酯键相连而成链状聚合物。,5,5,3,3,核苷酸和核酸ppt,第20页,多聚核苷酸结构特征,主链是相间出现磷酸戊糖残基经过共价键连接；,各种碱基排在主链外侧；,磷酸二酯键在主链中取向相同从,5,3,；,线性结构有,3,和,5,末端，即在,3,位置上缺乏核苷酸残基，,5,末端即在,5,位置上缺乏核苷酸残基。,3,端有游离羟基，,5,端有游离磷酸基。,核苷酸和核酸ppt,第21页,2.,一级结构,核苷酸排列次序,核苷酸和核酸ppt,第22页,A,G,P,5,P,T,P,G,P,C,P,T,P,OH 3,书写方法,5,p,A,p,C,p,T,p,G,p,C,p,T,-,OH,3,5,A C T G C T,3,5-,磷酸端（常见,5,-P,表示），,3-,羟基端（常见,3,-OH,表示）；,多聚核苷酸链含有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它方向是,53,或是,35,；,戊糖用垂直竖线表示，五个,C,从上到下依次为,15,。,线条式缩写,字母式缩写,核苷酸和核酸ppt,第23页,二、核酸高级结构,DNA,二级结构,双螺旋结构模型,tRNA,二级结构,三叶草结构模型,DNA,三级结构,超螺旋,核苷酸和核酸ppt,第24页,（,1,）,DNA,双螺旋结构模型提出依据,碱基组成份析,Chargaff 规则：A,=,T,G,C,碱基理化数据分析,A-T、G-C以,氢键配对较合理,DNA,纤维,X-,线衍射图谱分析,1.DNA,二级结构,双螺旋结构模型,核苷酸和核酸ppt,第25页,碱基互补配对,T,A,G,C,核苷酸和核酸ppt,第26页,（,2,）,DNA,双螺旋结构模型特征,（,Watson,Crick,1953,）,主链：,两条,反相平行,脱氧多核苷酸链围绕同一“中心轴”相互缠绕，形成双螺旋；两链以,-,脱氧核糖,-,磷酸,-,为骨架，碱基对位于双螺旋内侧；两条链均为,右手螺旋，,其磷酸二酯键方向相反。,核苷酸和核酸ppt,第27页,碱基配对：,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成,氢键配对,（互补配对形式：,A=T;G,C,）。,碱基参数：,螺旋直径为,2,nm，相邻碱基平面距离0.34nm，,螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,螺旋表面：,形成大沟,(,宽,1.2nm,，深,0.85nm),及小沟,(,宽,0.6nm,，深,0.75nm),相间。,核苷酸和核酸ppt,第28页,核苷酸和核酸ppt,第29页,（,3,）,DNA,双螺旋结构稳定原因,氢键,维持双链,横向稳定性,，,碱基堆积力,使双螺旋内部形成疏水区域，利于碱基间形成氢键，是维持,DNA,双螺旋稳定主要原因。,离子键,能降低双键间静电排斥，有利于双螺旋稳定。,核苷酸和核酸ppt,第30页,B,型结构,两条链反向平行，右手螺旋,碱基在内（,A,T,，,GC,）碱基平面垂直于螺旋轴,戊糖在外，双螺旋每转一周 为,10.5,个碱基对（,bp,）,A,型结构,碱基平面倾斜,20,，螺旋变粗变短，螺距,2,3nm,。,Z,型结构,左手螺旋，只有小沟,2.0 nm,小沟,大沟,（,4,）,DNA,双螺旋结构类型,核苷酸和核酸ppt,第31页,双螺旋,DNA,结构参数,类型,旋转方向,螺旋直径（,nm,）,螺距（,nm,）,每转碱基对数目,碱基对间垂直距离（,nm,）,碱基对与水平面倾角,A,DNA,B,DNA,Z,DNA,右,右,左,2.0,2.3,1.8,2.8,3.4,4.5,11,10,12,0.255,0.34,0.27,20,0,7,双螺旋稳定力,氢键,碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）,离子键等,DNA,变性剂（热、,pH,、脲,/,酰胺、有机溶剂）,核苷酸和核酸ppt,第32页,氨基酸,接收区,可变区,2.tRNA,二级结构,三叶草结构模型,四臂四环,氨基酸接收区（,1,臂）,反密码区（,1,臂,1,环）,DHU,区（,1,臂,1,环）,TC,区（,1,臂,1,环）,可变区（1环）,核苷酸和核酸ppt,第33页,*tRNA,三级结构,倒,L,形,*,tRNA功效,活化、搬运氨基酸到核糖体，参加蛋白质翻译。,核苷酸和核酸ppt,第34页,3,DNA三级结构超螺旋,定义：,DNA三级结构是指双螺旋基础上分子深入扭曲或再次螺旋所形成构象。超螺旋(superhelix)是常见形势之一。,形成：,DNA,是以双螺旋形式围绕着同一轴缠绕，当双螺 旋,DNA,这个轴再弯曲缠绕时，,DNA,就处于超螺旋状态，,DNA,超螺旋状态是结构张力表现。超螺旋是,DNA,三级结构一个主要特征。,正超螺旋,(positive supercoil),盘绕方向与,DNA,双螺旋方同相同,负超螺旋,(negative supercoil),盘绕方向与,DNA,双螺旋方向相反,核苷酸和核酸ppt,第35页,核苷酸和核酸ppt,第36页,核苷酸和核酸ppt,第37页,核酸性质及纯度测定,第 三 节,核苷酸和核酸ppt,第38页,一、核酸溶解性,溶解性,碱基、核苷酸和核酸含有不一样溶解性,0.14,摩尔法,分离,DNA,蛋白和,RNA,蛋白方法,多价解离,体内,DNA,呈多阴离子态,带电性：可用电泳、离子交换（色谱）分离,二、核酸解离,核苷酸和核酸ppt,第39页,三、核酸紫外吸收特征,在核酸分子中，因为嘌呤碱和嘧啶碱含有,共轭双键,体系，因而含有独特紫外线吸收光谱，普通在,260nm,左右有最大吸收峰，能够作为核酸及其组份定性和定量测定依据。,以A,260,/A,280,进行定性、定量,DNA,和,RNA,溶液中加入溴化乙锭（,EB,），在紫外下发出荧光,220,240,260,280,0.1,0.2,0.3,0.4,波长（,nm,）,光吸收,1,2,3,核苷酸和核酸ppt,第40页,2.,定量测定,核酸和核苷酸测定基础方法,1,）,DNA,或,RNA,定量 核苷酸,%=,A,260,=1.0,相当于,50,g/ml,双链,DNA,40,g/ml单链DNA（或RNA）,20g/ml寡核苷酸,2,）判断核酸样品纯度,DNA,纯品,:,A,260,/A,280,=1.8,RNA,纯品,:,A,260,/A,280,=2.0,Mr,A,260,260,C,100,核苷酸和核酸ppt,第41页,DNA,变性过程,加热,个别双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,1.DNA,变性,DNA,生物学功效实现所必需,定义,：,在一些理化原因作用下，,稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，,DNA,双链解开成两条单链过程。,四、,DNA,变性与复性,(denaturation),核苷酸和核酸ppt,第42页,原因：,过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及一些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它,理化,性质改变：,A,260,增高 粘度下降,比旋度下降 浮力密度升高,酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,核苷酸和核酸ppt,第43页,例：变性引发紫外吸收值改变,DNA,紫外吸收光谱,增色效应：,DNA,变性时其溶液,A,260,增高现象。,核苷酸和核酸ppt,第44页,热变性,解链曲线：,假如在连续加热,DNA,过程中以温度对,A,260,（,absorbance,，,A,，,A,260,代表溶液在,260nm,处吸光率）值作图，所得曲线称为解链曲线,。,核苷酸和核酸ppt,第45页,DNA,熔解温度,(,T,m,),定义：,在熔解曲线中，当,A260,到达最大值二分之一时，所对应温度。,影响,Tm,原因,DNA,均一性,介质中离子强度,G,、,C,含量,DNA,T,m,值与分子中,G,和,C,含量相关，,经验公式计算：,（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,核苷酸和核酸ppt,第46页,2.DNA,复性,核酸研究中常见伎俩,定义：,在适当条件下，变性,DNA,两条互补链可恢复天然双螺旋构象，并恢复相关性质和生理功效，这个过程称为,DNA,复性,。,减色效应,DNA,复性时，其溶液,A,260,降低。,热变性,DNA,经迟缓冷却后即可复性，这一过程称为,退火,(annealing),。,核苷酸和核酸ppt,第47页,粘度,核苷酸和核酸ppt,第48页,五、核酸含量与纯度判定,核酸含量测定,定磷法、定糖法,定磷法：,核酸含量,=,总磷含量,10.5,（,100,/,9.5,）,测定范围：,10,100,g核酸,定糖法：,RNA:D,核糖浓盐酸苔黑酚 绿色物质,DNA:D,2,脱氧核糖酸二苯胺蓝色物质,测定范围：,RNA,20,250,g;DNA,20250g,DNA纯度判定凝胶电泳,紫外吸收法测核酸纯度：,DNA,纯品,:,A,260,/A,280,=1.8,RNA,纯品,:,A,260,/A,280,=2.0,凝胶电泳法判定,DNA,纯度,：,纯,DNA,样品只有单一一条带，不然为非单一谱带,核苷酸和核酸ppt,第49页,DNA,碱基序列测定方法,测定基础步骤,链终止法（,SangerCoulson,方法）,DNA,化学降解法（,Maxam-Gilbert,）,自动,DNA,测序,RNA,碱基序列测定方法,六、核酸碱基序列测定,核苷酸和核酸ppt,第50页,Sanger,等,1977,年创造。,链终止法,Frederick Sanger,1980,年,Nobel Prize,化学奖,核苷酸和核酸ppt,第51页,（,1,）,DNA,复制是以一条链为模板，按,碱基配,对,标准进行。,（,2,）脱氧核糖连接是以,3,5,磷酸二脂键,。,（,3,）复制反应能够在,体外,进行。,（,4,）,2,和,3,双脱氧,ddNTP,会使复制反应终,止。,1,）,原理,核苷酸和核酸ppt,第52页,核苷酸和核酸ppt,第53页,核苷酸和核酸ppt,第54页,（,1,）制备单链,DNA,模板,2,）,技术关键点,就是待测序,DNA,链。,不能有,5,3,和,3,5,外切酶活性；,与模板亲和力高，不会提前脱离模板。,（,3,）特殊,DNA,多聚酶,dNTP/ddNTP=100/1,（,4,）制备,2,和,3,双脱氧,ddNTP,时,DNA,电泳带谱分离效果最好，可读出,200,多个核苷酸序列。,核苷酸和核酸ppt,第55页,需带有,放射性或荧光标识,。,（,2,）制备一小段单链引物（,DNA,或,RNA,）,核苷酸和核酸ppt,第56页,3.Sanger,双脱氧终止法测序过程,核苷酸和核酸ppt,第57页,核苷酸和核酸ppt,第58页,模板序列,核苷酸和核酸ppt,第59页,（,1,）非放射性标识,1981,年第一台商业化生产,DNA,自动测序仪诞生。,DNA,自动化测序,荧光物质标识。用激光能激发出,不一样颜色荧光。,1,）,技术关键点,（,2,）不一样标识对象,既可标识,引物,，也可标识,ddNTP,。,核苷酸和核酸ppt,第60页,（,4,）分析自动化,（,3,）读片自动化,激光探头直接读胶，实时阅读。,（,2,）反应自动化,Sanger,脱氧终止法。,电脑自动把荧光信号转化成对应碱基，并打印出,DNA,序列。,（,5,）反应可在一个试管中进行,标识,ddNTP,时。,核苷酸和核酸ppt,第61页,2,）,荧光标识引物自动化测序,分别用,4,种荧光物标识,引物,，,区分反应产物，,混合,电泳，,激光一次,读胶，,电脑,合成结果。,核苷酸和核酸ppt,第62页,核苷酸和核酸ppt,第63页,3,）,荧光标识,ddNTP,自动测序原理图解,4,种不一样荧光物分别标识,4,种,ddNTP,。,核苷酸和核酸ppt,第64页,可在同一管中进行,核苷酸和核酸ppt,第65页,可在单一泳道电泳。,核苷酸和核酸ppt,第66页,荧光标识终,止法测序,核苷酸和核酸ppt,第67页,测序结果,核苷酸和核酸ppt,第68页,第四节 核酸生物功效,核苷酸和核酸ppt,第69页,一、,DNA,复制与生物遗传信息储存,DNA,基础功效是以,基因,形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录模板。它是生命遗传物质基础，也是个体生命活动信息基础。,基因从结构上定义，,是指,DNA,分子中特定区段，其中核苷酸排列次序决定了基因功效。,核苷酸和核酸ppt,第70页,mRNA,结构特点,:,真核细胞mRNA3,-末端有一段长达200个核苷酸左右聚腺苷酸(polyA)，称为,尾结构,。,（参加mRNA从细胞核到细胞质转移；与其半寿期相关。）,5,-末端有一个甲基化鸟苷酸，称为,帽结构,。,（与翻译与mRNA稳定相关。）,二、,RNA,是生物遗传信息表示媒介,1.,基因转录,mRNA,合成,核苷酸和核酸ppt,第71页,DNA,mRNA,蛋白,转录,翻译,原核细胞,细胞质,细胞核,DNA,内含子,外显子,转录,转录后剪接,转运,mRNA,hnRNA,翻译,蛋白,真核细胞,核苷酸和核酸ppt,第72页,2.tRNA,和,rRNA,功效,tRNA,功效：将,mRNA,携带遗传信息翻译成氨基酸信息，并将对应氨基酸活化后，带到核糖体上进行蛋白质生物合成。,rRNA,功效：是组成核糖体主要组成成份，在蛋白质合成中起主要作用。,核苷酸和核酸ppt,第73页,RNA,种类、分布、功效,核苷酸和核酸ppt,第74页,三、生物遗传变异化学本质,DNA,结构改变,生物遗传变异分子机制是,DNA,分子中为氨基酸编码三联体密码改变。,四、核酸催化性质,核酶,1.,核酶组成和结构,2.,核酶催化作用,3.,核酶研究现实状况与展望,核苷酸和核酸ppt,第75页,第五节 核酸化学中几个主要技术,核苷酸和核酸ppt,第76页,在,DNA,变性后复性过程中，假如将不一样种类,DNA,单链分子或,RNA,分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度碱基配对关系，在适宜条件（温度及离子强度）下，就能够在不一样分子间形成,杂化双链,(heteroduplex),。,这种杂化双链能够在不一样,DNA,与,DNA,之间形成，也能够在,DNA,和,RNA,分子间或者,RNA,与,RNA,分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,*核酸杂交分子基础是？,一、核酸分子杂交,(hybridization),核苷酸和核酸ppt,第77页,核苷酸和核酸ppt,第78页,核苷酸和核酸ppt,第79页,核苷酸和核酸ppt,第80页,杂交种类,Southern,杂交（,Southern bolting,）,用于检测,DNA,Northern,杂交（,Northern bolting,）,用于检测,RNA,Western,杂交（,Western bolting,）,用于检测蛋白质,核苷酸和核酸ppt,第81页,研究,DNA,分子中某一个基因位置,定两种核酸分子间序列相同性,检测一些专一序列在待检样品中存在是否,是基因芯片技术基础,核酸分子杂交应用,核苷酸和核酸ppt,第82页,二、,PCR,（,Polymerase Chain Reaction,）技术,94,72,56,核苷酸和核酸ppt,第83页,核苷酸和核酸ppt,第84页,PCR,扩增过程中片段增殖计算,核苷酸和核酸ppt,第85页,PCR,反应体系确实立,Water,Buffer,（,10,）,Mg+,（,25mM,）,dNTPs,（,10mM,）,Primer1,（,10uM,）,Primer2,（,10uM,）,Taq,（,5U/uL,）,Templets,12.8,2,1.6,0.4,1,1,0.2,1,128,20,16,4,10,10,2,20uL,反应体系中各成份母液浓度及加入量,PCR,扩增程序举例,Tem.,94,94,56,72,72,Time,00:08:00,00:00:30,00:00:40,00:01:00,00:07:00,Cycles,35,核苷酸和核酸ppt,第86页,PCR,扩增结果分析举例,M 1 2 3 4 5 6 7 M,M,marker;1-2,PCR for CP4-EPSPS gene;3-4,PCR for 35S Promoter;5-6,PCR for lectin gene;7,Negtive control.,核苷酸和核酸ppt,第87页,三、基因定点突变,寡聚核苷酸,正常基因序列,不互补错配,第一：制备寡聚核苷酸和单链,DNA,M13,载体上基因,第二：合成互补链,DNA,聚合酶,dNTPs,寡聚核苷酸,合成出整个互补链,核苷酸和核酸ppt,第88页,第三：分离携带突变体噬菌斑,携带正常基因噬菌体,携带突变基因噬菌体,导入琼脂平版,含有突变基因噬菌斑,噬菌斑杂交,用标识寡聚核苷酸探针,噬菌斑,寡聚核苷酸定向突变方法,核苷酸和核酸ppt,第89页,其它定点突变方法,人工合成基因,5,3,5,3,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,重合寡聚核苷酸,新,DNA,人工合成基因,核苷酸和核酸ppt,第90页,其它定点突变方法,应用,PCR,构建定点突变,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,3,5,3,5,3,5,5,3,5,3,变性，引物退火,引物中含突变位点,突变两条链退火,最终,PCR,循环,突变体,应用,PCR,构建定点突变,核苷酸和核酸ppt,第91页,四、定向分子进化,定义：是应用当代生物技术伎俩，在分子水平上实践达尔文生物进化学说新探索。,技术原理：经过,DNA,或,RNA,突变、筛选和扩增不停循环，从而取得含有优良性能新品种分子。,定向分子进化基础过程（,P,97,：图,5-15,）,核苷酸和核酸ppt,第92页,