DNA粗提取与鉴定(用).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,的粗提取与鉴定,目的要求,1,、了解从细胞中提取,DNA,的基本原理,2,、初步掌握,DNA,的粗提取和鉴定的方法,3,、观察提取出来的,DNA,实验思路,1,、,DNA,从哪提取？,2,、怎样将,DNA,与细胞中的其他物质分离？,3,、怎样鉴定我们提取的,DNA,？,实验原理,1.DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度，是随着,NaCl,的浓度的变化而改变的。当,NaCl,的物质的量浓度为,0.14 mol,L,时,DNA,的溶解度最低。,利用这一原理，可以使溶解在,NaCl,溶液中的,DNA,析出。,2.DNA,不溶于酒精溶液,，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的,DNA,。,3.DNA,遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色,，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂。,实验材料和用具,实验材料：,1,、鸡血细胞液（,510ml,）；,2,、体积分数为,95%,的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却,24h,）；,3,、蒸馏水；,4,、质量浓度为,0,g/ml,的柠檬酸钠溶液；（抗凝剂）,5,、物质的量浓度分别为,2mol/L,和,0,015mol/L,的,NaCl,溶液；,6,、二苯胺试剂。,实验用具：,铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（,100ml,，一个）；烧杯；（,100ml,，一个，,50ml,、,500ml,各二个）；试管（,20ml,，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,8,、,DNA,的鉴定,DNA,与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂,紫外灯照射法,A,、,配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（,EB,）,B,、,将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴,EB,溶液染色,C,、,将蜡纸放在紫外灯,(260 nm),下照射（暗室中），可见橙红色的荧光,(DNA,的紫外吸收高峰在,260 nm,处,),甲基绿（蓝绿色）,二、,DNA,的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,材料：新鲜的鸡血,注意：,本实验中，,要往鸡血中加入抗凝剂,（,柠檬酸钠溶液,）,原则上只要含,DNA,的生物材料都可以，但是选取,DNA,含量相对较高的生物组织，成功率更大。,(1),先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞,(2),在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,1,、破碎细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,利用了什么原理？,2,、过滤，获取含,DNA,的滤液,讨论：为什么反复地溶解与析出,DNA,，,能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，,就能够除去与,DNA,溶解度不同的多种杂质,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的,DNA,与蛋白质分开；方案三利用的是,DNA,和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与,DNA,分离,方案二利用了酶的专一性；方案三利用了,DNA,的稳定性。,（四）,DNA,的,析出与鉴定,DNA,的析出用的是与滤液体积相等的,冷却的酒精溶液（体积分数为,95,）,，静置,2-3min,，,溶液中会出现,白色丝状物，,这就是粗提取,DNA,。,用玻璃棒沿,一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1,、,DNA,的析出,2,、,DNA,的鉴定,鉴定,DNA,时在试管中先加入物质的量的浓度为,2mol/L,的,NaCl,溶液,5ml,于两只试管中，其中一只加入,DNA,丝状物，各加入,二苯胺,4ml,试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热,5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有,DNA,的溶液是否有,蓝色,小结,1,、,DNA,的粗提取与鉴定的方法,2,、原理,3,、实验设计的步骤，原则,作业,尝试用植物细胞（如新鲜的菠菜）来做这个实验。,1,、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（）,A.,防止凝血,B.,加快,DNA,析出,C.,加快,DNA,溶解,D.,加速凝血,练一练,A,2,、,DNA,的溶解度最低时，,NaCl,的物质的量浓度为（）,A 2mol/l B 0.1mol/l,C 0.14mol/l D 0.015mol/l,3,、在向溶解,DNA,的,NaCl,溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）,A,加快,DNA,溶解的速度,B,加快溶解杂质的速度,C,减小,DNA,的溶解度，加快,DNA,析出,D,减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,C,C,4,、向溶有,DNA,的,2mol/L,的,NaCl,溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中,DNA,的溶解度变化情况分别是,A,减小,;,减小,B,增大,;,增大,C,先减小后增大,D,增大,;,减小,5,、欲使溶有,DNA,的,2mol/L,的,NaCl,溶液中的,DNA,析出，最有效的办法是,A,加蒸馏水,B,加矿泉水,C,加清水,D,加生理盐水,6,、与析出,DNA,粘稠物有关的叙述，不正确的是,A,操作时缓慢滴加蒸馏水，降低,DNA,的溶解度,B,操作时用玻棒轻缓搅拌以保证,DNA,分子的完整,C,加蒸馏水可以同时降低,DNA,和蛋白质的溶解度,D,当丝状粘稠物不再增加时，,NaCl,溶液的浓度可以认为是,0.14mol/L,7,、你能采用其他方法对,DNA,进行鉴定吗？,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,8,、,DNA,遇二苯胺会染成（沸水浴）,A,硅红色,B,红色,C,紫色,D,蓝色,D,（一）案例一：以鸡血为实验材料进行,DNA,的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1,、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的,DNA,含量丰富，材料易得,2,、实验原理,DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度，是随着,NaCl,的浓度的变化而改变的。当,NaCl,的物质的量浓度为,0.14 mol,L,时,DNA,的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在,NaCl,溶液中的,DNA,析出。,DNA,不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的,DNA,。,DNA,遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂。,4,、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为,0,1g/ml,的,柠檬酸纳溶液（抗凝剂）,100ml,，,置于,500ml,烧杯中。注入新鲜的鸡血（约,180ml,），,同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用,1000r/min,（,转每分）的离心机离心,2min,，,血细胞沉淀于离心管底部。实验时。,用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的,Ca,2+,发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的,Ca,2+,大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的,DNA,，,容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少,DNA,的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,讨论：提取鸡血中的,DNA,时，为什么,除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5,、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液,5,mL,10mL,，,注入到,50,mL,烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水,20,mL,，,同时用,玻璃棒,充分搅拌,5 min,，,使血细胞加速破裂。,然后，用放有,纱布的漏斗,将血细胞液过滤至,500mL,。,取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（,1,）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（,2,）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎,DNA,（,3,）滤去的是什么物质？,得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的,DNA,溶解细胞核内的,DNA,将氯化钠的物质的量浓度为,2 mol,的溶,40mL,加入到滤液中，并用,玻璃棒沿一个方向搅拌,1min,，,使其混合均匀，这时,DNA,在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用,玻璃棒不停地轻轻搅拌，,这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于,0.14 mol,L,）,析出含,DNA,的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低,NaCl,溶液浓度到使,DNA,溶解度最低点，使,DNA,从,NaCl,溶液中析出,将溶液中的,DNA,与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于,DNA,分子的附着和缠绕,注意事项：,滤取含,DNA,的粘稠物,用放有,多层纱布,的漏斗，过滤步骤,3,中的溶液至,500mL,的烧杯中，含,DNA,的,粘稠物被留在纱布上,将,DNA,的粘稠物再溶解,取,1,个,50,mL,烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为,2 mol,L,的溶液,20mL,。,用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，,用玻璃择不停地搅拌，,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有,DNA,的氯化钠溶液,取,1,个,100,mL,烧杯，用放有,两层纱布,的漏斗过滤步骤,5,中的溶液。取其滤液，,DNA,溶于滤液中,提取含杂质较少的,DNA,在上述滤过的溶液中，加入,冷却的、酒精的体积分数为,95,的溶液,50mL,（,使用冷却的酒精，对,DNA,的凝集效果较佳），并用,玻璃棒搅拌，,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是,DNA,答：因为,DNA,不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的,DNA,丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（,2,）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（,1,）为什么要加,50mL,的冷酒精？,取两支,20,mL,的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为,0,015 mol,L,的溶液,5,mL,，,将丝状物放入其中一支试管中，,用玻璃棒搅拌，,使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入,4mlL,的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热,5 min,，,待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA,的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（,2,）这一鉴定结果说明什么问题？,（,1,）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是,DNA,（,3,）,DNA,的直径约为,2010-10 m,，,实验中出现的丝状物的粗细是否表示,1,个,DNA,分子直径的大小？,答：,DNA,分子直径只有,2 nm,。,丝状物是多个,DNA,子聚在一起形成的,答：整个实验共“两次,蒸馏水，,三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6,、,讨论：,两次,蒸馏水,第一次：,细胞吸水胀破,第一步,第二次：使,DNA,黏稠物析出 第三步,（,1,）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为,1,2,层,三次过滤,第一次：,DNA,存在于滤液里 第一步,第二次：,DNA,被,留在纱布上 第四步第三次：,DNA,存在于滤液里 第六步,两次析出,第一次：用,0.14 mol,L,的,NaCI,溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的,95,的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的,DNA,（,2,）为什么反复地溶解与析出,DNA,，,能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，,就能够除去与,DNA,溶解度不同的多种杂质,（二）,案例二：以菜花为实验材料进行,DNA,的粗提取,1,、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为,95,的乙醇溶液放入冰箱冷冻室,24 h,2,、提取,DNA,的具体步骤,取材：称取,30 g,菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入,10,mL,研磨液，充分研磨,10 min,研磨液的配制方法如下：将,10.1 g,Tris,加入到,50,mL,蒸馏水中，使其溶解，然后，用,2,moL,/L,的,HCl,溶液调节,pH,至,8.0,，再加入,8.76 g,NaCl,、,37.2 g EDTA,、,20 g SDS,。,待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至,1 000,mL,Tris/HCl,:,提供缓冲体系，,DNA,在这一体系中呈稳定态（,Tris,为三羟甲基氨基甲烷）,EDTA,（,乙二胺四乙酸二钠）：是,DNA,酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后,DNA,酶降解,DNA,SDS,（,十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与,DNA,分离,过滤：,在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中,(,有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用,1000 r/min,的转速，离心,2,5 min,，,取上清液放入烧杯中,),。在,4,冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：,将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为,95,的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液,(,玻璃棒不要直插到烧杯底部,),。沉淀,3,5 min,后，可见白色的,DNA,絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,观察你提取的,DNA,颜色，如果不是白色丝状物，说明,DNA,中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的,DNA,含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（一）是否提取出了,DNA,本实验提取的,DNA,粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,（二）分析,DNA,中的杂质,（三）不同实验方法的比较,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如,DNA,的纯度、,DNA,的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好,