分子荧光光谱法Molecular fluorescence spectroscopy.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Molecular fluorescence spectroscopy,分子荧光光谱法,概述,分子荧光光谱法,(,Molecular fluorescence spectroscopy,),又称为荧光光谱法或荧光分析法是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析,光致发光（,Photoluminescence,）,:,荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象,.,荧光：,受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。,磷光：,从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。,荧光分析法的特点,灵敏度高。检测限比吸收光谱法低,13,个数量级；,选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；,试样用量少和方法简便,能提供比,;,光多的物理参数,应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。,荧光光谱法基本原理,分子的激发与失活,1.,分子的多重态,单重态,一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。,三重态,有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。,1.,激发,在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重态当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需,-15,秒,.,激发,2,去活化过程,激发态分子的失活,:,激发态分子不稳定，它要以辐射,或无辐射跃迁的方式回到基态,振动驰豫,(Vibrational relaxation),荧光发射,(Fluorescence),内部转换,(Inter-nal Conversion),体系间跨越跃迁,去活化过程,激发,去,活化过程,荧光强度及影响荧光的因素,荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（,F,）,与荧光物质的吸光强度,I,a,及其荧光物质的荧光效率,成正比,。,1.,荧光强度与浓度的关系,F=,I,a,其中,I,a,=,I,0,I,I,0,入射光辐射功率；,I,透射光辐射功率；,荧光效率（荧光量子产率）,荧光量子产率,物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（,）,表示,：,与失活过程的速率常数,k,有关,凡是使荧光速率常数,k,f,增大而使其他失活过程,（系间窜越、外转换、内转换）,的速率常数减小的因素都可使荧光增强,。,根据朗伯,-,比尔定律,Ia=I,0,-I=I,0,(1-10,-bc,),则,F=I,0,（,1-10,-bc,)=I,0,(1-e,-2.303bc,),又因,e,-2.303bc,=1-2.303 bc-(-2.303 bc),2,/2!-(-2.303 bc),3,/3!,对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到,2%,时，,即,bc,=0.05,时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则,F=I,0,1-(1-,2.303,b,c),=2.303,I,0,b,c,当,I,0,一定时 并且浓度,C,很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比,F=KC (K=,2.303,I,0,b,),荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过,0.05,时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离,.,荧光与环境因素的关系,温度,降低会使荧光强度增大；,PH,带有酸性或碱性取代基的芳,香化合物的荧光与,pH,有关；,溶剂,溶剂极性增加有时,会使荧光强度增加，荧光波长红移；,若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧,光物质电离状态改变，会使荧光强度,、荧光波长改变；含重原子的溶剂,（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。,溶解氧,的存在往往使荧光强度,降低。,激发光的照射,化合物,相对荧光强度,C,6,H,5,OH,18,C,6,H,5,O,10,C,6,H,5,NH,2,20,+,C,6,H,5,NH,3,0,荧光分光光度计,荧光分光光度计既可用于定量分析，,也可用于测绘激发光谱和荧光光谱,。,荧光分光光度计既可用于定,量分析，也可用于测绘激发光谱,和荧光光谱。第一单色器选择激,发光波长（,250nm,的,紫外光）故称为激发单色器,第二单色器（荧光单色器）,与激发光入射方向垂直，,并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。,荧光分析法的应用,无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光,.,但很多无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定,.,生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生物化学分析,生理医学和临床分析,.,药物分析,目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物,.,荧光团杂化纳米二氧化硅微球,