从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴定一种酶.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/12/13,#,生物大分子的分离纯化和,特定酶分离纯化技术路线的设计,1,目录,1.,研究目的,2.,主要内容,3.,研究方法和手段,4,.,文献综述,5.,工作进度安排,6,.,预期成果,2,1.,研究目的,锻炼自主学习和查阅文献的能力,锻炼设计实验的能力,3,2.,主要内容,自主设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线,设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶的技术路线并理解实验各步骤的原理,4,3.,研究方法和手段,研究方法：文献研究法,搜集整理相关研究资料为研究做准备,研究手段：以传统文献检索手段为主，辅以网络、数据库等手段，开展资料、搜集数据整理等工作,5,4,.,文献综述,生物大分子的分类：蛋白质、核酸、脂质、糖类,接下来分类讲解如何从生物样品中分离纯化以上四类生物大分子的技术路线,6,4.1.1,蛋白质的分离纯化,分离方法：透析超滤除蛋白质溶液中的小分子化合物,浓缩方法：丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀,纯化方法：电泳、层析,7,4.1.2,核酸的分离纯化,DNA,先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原；,然后利用淀粉酶除去多糖；,在,浓磷酸盐存在下，以,2-,甲氧基,乙醇抽提核酸提取,液，以钙盐沉淀,DNA,，再以草酸钾处理，使之形成,DNA,钾盐回收，然后用离子交换法吸附,DNA,，使之与多糖,分离,；,利用,去污剂或氯仿,-,戊,/,辛醇或苯酚,处理后除去,蛋白质；,利用,胰脏,核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去,RNA,。,8,4.1.2,核酸的分离纯化,RNA,前四步与,DNA,的分离纯化方法相同，之后可通过苯酚水溶液抽提或脱氧核糖核酸酶处理除去,DNA,。可再利用柱,层析、梯度离心及逆流分,溶等方法提取所需种类,RNA,。,9,4.1.3,脂质的分离纯化,利用,Folch Method,从组织中分离和纯化脂质,先,配制氯仿,/,甲醇,=2/1,（,v/v,），取组织液,1:20,的量和氯仿,/,甲醇一起组织匀浆，分层后在室温下在摇床中摇动,15,到,20,分钟,匀浆通过滤纸过滤或者离心获得液体,在,离心获得的液体中加入,0.2,倍体积（,4ml,）的水或者,0.9%,的生理盐水涡旋几秒钟后混匀，然后,2000rpm,离心得到两相溶液，通过虹吸去掉上层用作神经节苷脂类的分析和有机小的极性分子的分析，如果需要的话用甲醇,/,水（,1/1,）的溶液将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让甲醇,/,水与下层混合,通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相中含有脂质，如果体积在,2,到,3ml,以下，则通过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩,10,4.1.4,糖类的分离纯化,提取：动物多糖和,微生物,多糖多有脂质包围，一般,需要,先加入丙酮、乙醚、乙醇或,乙醇乙醚,的混合液进行回流脱脂，,释放,多糖,。,分离：分级沉淀,法、金属络合物法、,制备性,区域电泳、色谱分离法和膜,分离,法。其中分级沉淀法主要有,有机,溶剂分步沉淀法、盐析法及,季铵盐,沉淀法；色谱分离法分为,凝胶,柱色谱和离子交换色谱法；,膜分离,法主要有超滤和微滤法,。,纯化：,Sevagr,法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、盐酸法、酶法、有机溶剂混合法除去蛋白质,。用透析法,、柱离子交换法和纤维滤器,透析法去离子。,11,4.2,设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和,鉴定,一,种 酶（该酶由三种不同的亚基组成，为结合酶，,pI=6.2,）的,技术路线并理解实验各步骤的,原理,材料的选择,技,材料的预处理,术,酶的提取,路,酶的分离,线,酶的纯化,酶纯度的检验,12,4.2.1,材料的选择,因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿,24,小时的动物肝脏为实验材料。,13,4.2.2,材料的预处理,细胞破碎：机械,破碎,法。可选,用捣碎法或匀浆法,。使用,匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机,或研磨,器械捣碎分散,。,防止蛋白酶的水解作用：预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（,PMSF,）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有,EDTA,和,EGTA,（乙二醇四乙酸,）,除核酸：除核酸的常用方法是,沉淀法。,14,4.2.3,酶的提取,盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数,P,酶,在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低。,15,4.2.4,酶的分离,等电点沉淀法：已知所需酶的,pI=6.2,，故适宜采用此种方法进行分离。,等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同,两性电解质的,等电点不同这一特性，通过调节溶液的,pH,值，使酶或杂质沉淀析出，,从而使,酶与杂质分离的方法。在溶液的,pH,值等于溶液中某两性电解质的等电点时,，该,两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集,在一起,而沉淀下来。因此可以通过调节介质的,pH,，把目的酶和杂蛋白分开。,但由于,蛋白质在,pI,点附件一定范围的,pH,内都可发生沉淀，只是沉淀的程度,很不一样,，而且相当多的蛋白质的,pI,点很靠近，所以该法的回收率和纯化,倍数都,不理想，一般只用于酶的粗分离阶段,。,16,4.3.5,酶的纯化,结晶：盐析结晶法,加,固体,盐法、饱和,盐溶,液、透析扩散法。,浓缩：真空蒸发,浓缩,在,一定的真空条件下，使酶液在,60,以下汽化蒸发，进行,浓缩,的,过程。一般说来，在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低,压力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高,。,干燥：,真空干燥法,真空干燥,是在与真空系统相连接的密闭干燥器中，一边抽,真空,一边加热，使酶液在较低的温度条件下蒸发干燥的过程。在真空泵,之前,需要设置水蒸气凝结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。,酶液,真空干燥的温度一般控制在,60,以下。,17,4.3.6,纯度的检验,酶纯度的检验：对该酶进行,SDS-PAGE,电泳，若仅出现,3,条色带，则说明酶以纯化,成功,。,18,请老师和同学们批评指正！,19,