实验植物细胞切片的制作.ppt

,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,二、实验用品和材料,1,、显微镜、尖嘴镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸、解剖针、纱布、碘液。,2,、蚕豆（芹菜）茎和叶,3,、洋葱或玉米根尖纵切永久制片,4,、南瓜或向日葵茎横、纵切永久制片,.,5,、洋葱鳞叶、马铃薯块茎。,.,三、内容与方法,（一）临时切片制作,、徒手切片法（重点）,、整体装片,适合于植物体形小而扁平的材料。如菌丝、孢子束、藓类。,、涂抹法,用于极小的植物体或组织。如细菌，酵母，花粉，淀粉，晶体等。,.,4,、撕片法,适用于某些植物茎、叶容易撕下表皮的植物，如洋葱鳞茎、蚕豆叶等。,5,、压片法,适用于幼嫩组织中细胞的观察，如根尖，茎尖生长点的细胞有丝分裂及花粉母细胞染色体等。,.,徒手切片法,.,徒手切片法,1,、取材,选取待观察的植物材料，初步切取大约3cm长的小块，再依切片的具体要求，将组织块修整为0.5cm的材料块。,.,2,、切片,1,）以左手夹住材料，用右手平稳地握住刀片。,2,）使刀片与材料的断面保持平行，刀口自左上方斜向右下方，动作要均匀有力。,3,）材料与刀片须常以水湿润。,4,）切下的薄片，立即用毛笔蘸水后粘取，移入盛有清水的培养皿内。,.,3,、选片,1,）切片完整，在培养皿中选择薄而均匀，且切面完整的组织切片捞出,;,2,）放在载玻片上作临时水装片，然后置于显微镜下观察；,3,）如果结构能被清晰地显示出来，则可制成永久保存封片。,.,石蜡切片机,.,（二）永久装片的制作,1,、材料预处理,将材料装在,25ml,规格的小指管，加入甘油,酒精软化剂（甘油,1,份，,70%,酒精,1,份）,8ml,封盖后在电热恒温水浴锅,5018h,，第二天升温至,608h,进行软化。,.,2,、蜡块制取,1）逐级脱水,将上述经软化的材料转入250ml已洗净的输液瓶中加入40ml，70%酒精脱水24h。分别加入各级酒精40ml，70%酒精脱水24h，85%酒精脱水12h，95%酒精脱水2h，无水酒精脱水1h。同时回收各级酒精。,2）染色,番红酒精染液染色（1g番红溶于100ml 50%酒精中，纱布过滤）染色24h。,.,3）透明,转入1/2二甲苯1/2无水酒精混合液20ml透明1h，纯二甲苯20 ml透明1h,再用纯二甲苯20ml透明40min，并回收各液。,4）浸蜡,将透明过的材料转入50ml小烧杯,在恒温箱内加入预先在温度保持在5658恒温箱溶化并过滤的石蜡15ml，使材料完全被纯二甲苯与石蜡浸没，并使温度保持在3638,过夜浸蜡24h，待二甲苯完全挥发，回收石蜡,再加入溶化并过滤的纯石蜡40ml，温度保持在36381h，升温至56，使石蜡保持溶化状态。,.,5,）包埋：,将浸蜡完全的材料倒入预先制成的光滑的硬纸（,10.01.01.0,）制成的纸盒中制取蜡块，在恒温箱门的低坎处摆好纸盒，并写上名称，使其一面紧贴恒温箱的受热金属板，纸盒底面紧贴恒温箱底面金属板，倒入溶化石蜡,0.2,0.3,厚的薄层，,2min,后待薄层稍有凝固时将材料依次排列于其上，再倒入溶化石蜡，并用烧热的解剖针刺破其中的气泡，提着纸盒两端预留的盒耳将纸盒浸入盛有冷水的盆中冷却制成石蜡块。,.,6,）石蜡块的修整：,剥去纸盒，用锐利的单面刀片把石蜡块切分为,2,长的小蜡块，并将各小蜡块的各面修整平，再将其修成长楔形。,3,、切片,1）固定石蜡块：,用在酒精灯上预热好的解剖刀，融化修整好的石蜡块中少许蜡后，立即粘牢在小木块（2.5,21.5cm）上，待蜡完全凝固结实后，将小木块夹入切片机的固定夹板中固定；,2,）切片：,调整切片机的切片厚度为814,m,切取石蜡块薄片。,.,4,、粘贴展平,选取洁净的载玻片，于中央用火柴棒粘取明胶粘贴剂（明胶,2g,电热恒水浴锅,60,水浴溶于,1000ml,蒸馏水，纱布过滤），展成一薄层或滴加一滴蛋白甘油（取鸡蛋一个敲破流出蛋清，甘油即丙三醇，此粘贴剂较明胶粘贴剂理想），用细玻棒展成一薄层，加蒸馏水一滴，挑取理想的蜡带贴于粘贴剂上，在酒精灯火焰稍过,3,4,来回，或恒温,37,展片台,6min,，使蜡展在粘贴剂上并展平。将展平的材料连同一侧贴有标签的载玻片，置于,37,电热恒温箱,24h,，使水分蒸干，或恒温,37,展片台,12h,，或室内自然晾干。,.,5,、染色制片,1,）脱蜡：,将粘有蜡片的载玻片排列在装片架上，转入盛有,400ml,纯二甲苯的,1000ml,大烧杯中,20min,，杯口用塑料袋封严，再转入盛有,400ml,纯二甲苯的,1000ml,大烧杯中,10min,，杯口同样用塑料袋封严，使石蜡完全溶解。,2,）过渡：,将脱蜡完全的装片架转入盛有,400ml1/2,二甲苯,1/2,纯酒精混合液的,1000ml,大烧杯中过渡,5min,，杯口仍用塑料袋封严。,.,3,）下降至,70%,酒精（水）：,分别经,400 ml,纯酒精、,95%,、,85%,、,70%,酒精割,400 ml,（,50%,及,30%,酒精下降至蒸馏水），并回收各液。,4,）番红复染色：,400 ml 1%,番红酒精（水液）再染色,2h,。回收染液，并用自来水洗去多余的染液。,5,）继续脱水：,用,30%,、,50%,和,70%,酒精,400 ml,各处理,30s,1 min,，并回收各液。,6,）固绿复染：,用,0.1%,固绿的,95%,酒精,400 ml,复染,10,30s,，回收染液。,.,7,）再继续脱水：,用,95%,酒精和两次纯酒精彻底脱水，每次,10 s,1 min,，回收各液。,8,）透明：,用纯酒精和二甲苯各半的混合液,400 ml,处理,5 min,，再用,400 ml,纯二甲苯浸,5 min,，使材料完全透明，并回收各液。,9,）封片：,将载玻片自二甲苯中取出，立即滴一滴用二甲苯溶解的加拿大树胶于材料之上，加盖盖玻片。置玻片标本于烘箱中烘干即可。,.,