动物病毒的分类及常见病毒的分子结构.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,动物病毒的分类及常见病毒的分子结构,第一节 动物病毒的分类,一、概述,根据国际病毒分类委员会(ICTV)1995年的第六次报告，现在已知的病毒有3600多种，它们分别属于71个病毒科中，其中动物病毒(包括脊椎动物病毒和无脊椎动物病毒)有2000余种，分属27个病毒科，而且可以肯定还有许多未被发现的新的动物病毒存在，或者还有新的病毒即将产生。,.,病毒分类不仅有利于对已知病毒的认识和研究，促进对未知新病毒的发现，而且有助于对病毒的利用以及对病毒病的控制。例如我们可以根据同科或同属病毒之间共同抗原的存在，利用同科异属或同属异种的病毒进行免疫预防。应用牛痘苗预防人的天花就是一例，虽在当时仅仅是一种偶然的发现。应用鸽痘病毒预防鸡痘，应用火鸡疱疹病毒预防鸡的马立克氏病(也是一种疱疹病毒性疾病)，用猪呼吸道冠状病毒（PRCV）疫苗预防TGEV,也都是这方面的明显例子。,.,一个理想的动物病毒分类方案，既要反映病毒之间的内在联系，又能被广大病毒工作者所接受，也就是说，应在着重依据病毒本身特性的同时，相应考虑使用时的方便，要有利于人们了解和研究病毒的本质，有利于人们利用和开发病毒以及开展病毒性疾病的预防、诊断和治疗。这也是1966年7月在莫斯科召开的第九届国际微生物学会议上专门成立国际病毒命名委员会(简称ICNV，1973年后改称国际病毒分类委员会，简称ICTV)的原因，ICTV的任务是建立适合所有病毒通用的分类系统，以便统一协调病毒的分类和命名。,.,二、病毒分类和命名的规则,1.病毒的分类规则,ICTV的分类规则以病毒的基本特性为依据，这些特性概括起来包括以下几个方面。,(1)病毒的形态学：,病毒粒子的大小和形状，呈球形、子弹状、砖形、卵形或杆状、丝状还是多形态；有无表面纤突及纤突的特征；有无囊膜；衣壳对称型和结构、立体对称、螺旋对称、还是复合对称；立体对称病毒粒子的壳粒数目或螺旋对称病毒的核衣壳直径。,.,(2)理化学特性：,病毒粒子的分子量、浮密度、沉降系数，对酸碱(pH)的稳定性，对热的稳定性，对两价离子(Mg,+,和Mn,+,)的稳定性，对脂溶剂(乙醚或氯仿)的稳定性，对去污剂的稳定性，对幅射的稳定性。,(3)基因组：,核酸类型(DNA或RNA)；基因组大小(kb)；是单股还是双股、线状还是环状；正义、负义或双义；是整个的还是分节段的，节段的大小和数目；核酸的序列或部分序列，是否具有重复序列，是否有同聚物，G+C含量；5端帽的存在与否和类型，5端共价结合蛋白存在与否，3端多聚A尾的存在与否。,.,(4)基因组组成和复制策略，开放阅读框架的数目和位置，转录特征，翻译特征，翻译后加工特征。,(5)蛋白质：结构蛋白的数目、大小和功能活性，非结构蛋白的数目、大小和功能活性；蛋白质的特殊功能活性，尤其是转录酶、反转录酶、血凝素、神经氨酸酶和融合特性；氨基酸序列或部分序列，糖基化、磷酸化、豆寇酸化的程度；表位图谱。,(6)脂质含量和特性；糖类含量和特性。,.,(7)在细胞培养中的生长特性：,包括对细胞种类的特异性，病毒蛋白的聚集场所，病毒粒子的装配场所，病毒粒子成熟和释放的部位和性质。,(8)抗原性：,与其它相关病毒的血清学关系。,(9)生物学特性：,包括自然宿主范围，传播方式，传播载体，地理分布，致病性及与疾病的关系；组织嗜性，病理学和组织病理学。,.,2.病毒的命名规则,一般规则,(1)病毒的分类和命名应是国际性的，应普遍适用于所有病毒。,(2)通用的病毒分类系统采用目、科、亚科、属和种的等级制度，在种的命名尚不完善的情况下，许多病毒可用国际通用的俗名。,(3)ICTV不统一规定病毒种以下的分类和命名。关于血清型、基因型、病毒株、变异株等的命名由公认的国际专家组决定。,(4)对人工产生的病毒和实验室杂交株不予分类考虑，这些病毒的命名也同样由公认的国际专家组决定。,(5)当代表成员病毒经过充分鉴定并在发表的文献上描述后，才能建立一个类，以便与相似的类区别。同样，命名一个病毒时，该病毒必须经过充分鉴定并在文献上发表以明确区别于相似的病毒。,.,关于类和病毒的命名规则,(6)现有的类和病毒的名称无论是否适用均应予保留。,(7)在类和病毒的命名中不遵守优先率。,(8)不使用人名。,(9)类和病毒的名称应便于使用，容易记忆，最好使用听起来悦耳的名称。,(10)不使用下标、上标、连字符、斜杠和希腊字母。,(11)新名称不应与已通过的名称有重复，应选用与正在使用的或过去使用的名称不相近的名称。,.,(12)如果缩拼词对病毒学家有意义，且得到公认的国际专家组的推荐，可以接受作为类的名称。,(13)由一个类或病毒的名称所隐含的任何意义都会因在名称中涉及不是所有成员或潜在成员所具有的特征以及不是均等地适用于不同类的特征而排斥该类中的合适成员病毒，这种情况应当避免。,(14)新名的选用应考虑国家或民族敏感性问题。应采用那些被病毒学家在科学杂志上发表的工作中常用的名称及其衍生名称应作为命名的基础，此时可不必考虑国家来源；在有一个以上的候选名称时，相应的研究组或分委员会向ICTV执行委员会提出建议，由执行委员会决定取哪一个名称。,.,(15)新的名称和名称的变更应以分类建议格式提交ICTV。,(16)病毒种是组成一个复制系并占有一个特定生态环境的一类多原则病毒。,(17)种名应由少而实用的字组成。,(18)种名，通常与株名一起，必须表示明确的特征，不涉及属名或科名。,(19)已经广泛应用的数字、字母及其组合可用作种名性质形容词。但新提出的连续数字、字母或其组合不单独接受作为种名性质形容词。,(20)ICTV通过新提议的种、种名和型名的程序分两步：首先，给予暂时性通过，这样的建议将发表在ICTV报告中；然后，经过三年的等候期，如果不撤销或修正，该建议将得到最后通过。,.,关于属的规则,(21)属是一组具有某些共同特性的种。,(22)属名应是一个以“virus”结尾的单词。,(23)通过一个属名的同时需通过一个代表种。,关于亚科的规则,(24)亚科是一组具有某些共同特性的属。只有当需要处理复杂等级结构问题时才使用亚科。,(25)亚科名应是一个以“virinae”结尾的单词。,.,关于科的规则,(26)科是一组具有某些共同特性的属(不管这些属是否组成了亚科)。,(27)科名应是一个以“viridae”结尾的单词。,(28)通过一个科名的同时需通过一个属名。,关于目的规则,(29)目是一个具有某些共同特性的属。,(30)目名应是一个以“virales”结尾的单词。,.,三、动物病毒的基本类型,根据病毒核酸及其转录和复制方式，可将动物病毒分为下述7个基本类型。,第一类病毒是具有双链DNA(dsDNA)基因的病毒，包括痘病毒以及乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒等。,其中只痘病毒DNA转录mRNA的依赖DNA的RNA聚合酶(即转录酶)紧密结合于病毒粒子的核心上，其他三类者可能都是利用宿主细胞的转录酶。,.,痘病毒的脱壳过程分为两个步骤：首先是脱除外膜，露出类核体核心，核心内的转录酶此时开始活化，转录出早期mRNA；随后则是核心的进一步脱蛋白，使病毒DNA游离出来。早期mRNA合成蛋白，包括胸苷激酶、DNA聚合酶和DNA酶等酶类以及可在成熟病毒粒子中发现的其他一些蛋白质，但病毒结构蛋白大多是晚期产生的，亦即是晚期mRNA的译制产物。,.,乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒都在胞核内转录mRNA。mRNA在产生后立即离开胞核，进入胞浆，并与核糖体结合，形成聚核糖体。疱疹病毒的早期和晚期转录没有明显界线，其所译制的蛋白质也无明显的早、晚期之分。但乳多空病毒和腺病毒的结构蛋白都是晚期蛋白，产生于病毒DNA复制之后。其早期蛋白也是一些酶类和少数非结构蛋白。,.,这类病毒的DNA复制按模板方式进行，呈半保留型。首先，联结双链的氢键断开，变为两条单链。两条单链中的每个碱基通过互补方式，各自形成一条新链。这样，子代的双链中各有一条来自母代原来的链，即母代的一半被保留下来(见图4-5)。,.,.,dsDNA如下：,1、痘病毒科(Poxviridae),1.1脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae),正痘病毒属 代表为痘苗病毒；,副痘病毒属 代表为口疮病毒；,禽痘病毒属 代表为鸡痘病毒；,山羊痘病毒属 代表为绵羊痘病毒；,兔痘病毒属 代表为粘液瘤病毒；,猪痘病毒属 代表为猪痘病毒；,软疣痘病毒属 代表为触染性软疣病毒；,YATA痘病毒属 代表为Yaba猴肿瘤病毒,1.2昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae),昆虫痘病毒A属 代表为鳃角金龟痘病毒；,昆虫痘病毒B属 代表为桑红缘灯蛾痘病毒；,昆虫痘病毒C属 代表为淡黄摇蚊痘病毒,；,.,2、未确定科,“类非洲猪瘟病毒属”代表为非洲猪瘟病毒；,3、虹彩病毒科(Iridoviridae),虹彩病毒属 代表为蜈蚣虹彩病毒；,绿彩病毒属A属 代表为蚊虹彩病毒；,蛙病毒属 代表为蛙病毒3型；,淋巴囊肿病毒属 代表为比目鱼病毒；,“类金鱼病毒1型属”代表为金鱼病毒1型；,4、杆状病毒科(Baculoviridae),核型多角体病毒属 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒,颗粒体病毒属 印度谷螟颗粒体病毒,.,5、疱疹病毒科(Herpesviridae),5.1甲疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae),单纯疱疹病毒属 人疱疹病毒1型,水痘病毒属 人疱疹病毒3型,5.2 乙疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae),细胞巨化病毒属 人疱疹病毒5型,鼠巨化病毒属 鼠细胞巨化病毒1型,玫瑰疹病毒属 人疱疹病毒6型,5.3丙疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae),淋巴隐伏病毒属 人疱疹病毒4型,蛛猴病毒属 蛛猴疱疹病毒2型,.,疱疹病毒科动物的常见病毒有：,伪狂犬病病毒,马鼻肺炎病毒,牛传染性鼻气管炎病毒,牛溃疡性乳头炎病毒,恶性卡他热病毒,猪包涵体鼻炎病毒,犬疱疹病毒,猫鼻气管炎病毒,鸡马立克氏病病毒,鸡传染性喉气管炎病毒,鸭瘟病毒,.,6、腺病毒科(Adenoviridae),哺乳动物腺病毒属 人腺病毒2型,禽腺病毒属 鸡腺病毒1型,7、乳多空病毒科(Papovaviridae),多瘤病毒属 鼠多瘤病毒,乳头状瘤病毒属 兔乳头状瘤病毒,8、多DNA病毒科(Polydnaviridae),姬蜂病毒属 一种姬蜂病毒,茧蜂病毒属 一种茧蜂病毒,.,第二类病毒是具有单链DNA（ssDNA)基因的病毒。细小病毒为其代表。借助于依赖DNA的DNA聚合酶由单链母代DNA复制出相应的单链DNA(负链)，随后再由这个双链DNA的负链合成子代正链DNA。,这类病毒DNA作为模板合成一条相应的新链。新链与老链之间以氢键联结。新合成的双链DNA中间体再按半保留方式复制出又一对双链DNA。其中不含母代DNA的新合成双链DNA只能作为转录mRNA的模板，不能继续复制新的双链DNA。而含有母代DNA的新合成双链DNA，则按保留型方式以双链DNA的负链作模板复制出新的单链子代核酸。,.,所谓保留型复制，是指母代双链DNA在复制子链过程中，一方面产生子链，一方面母链又重新结合，结果在产生的两个子代中，一个仍是母代原来的双链(见图4-6)。,.,ssDNA,包括有：,1,、圆环病毒科,(Circoviridae),圆环病毒属 鸡传染性贫血病毒,猪圆环病毒,2,、细小病毒科,(Parvoviridae),2.1,细小病毒亚科,(Parvovirinae),细小病毒属 猪（牛、鸡、马）细小病毒,红病毒属,B19,病毒,依赖病毒属 腺联病毒,1,型,2.2,浓核病毒亚科,(Densovirinae),浓核病毒属 鹿眼蛱蝶浓核病毒,ITERA,病毒属 家蚕浓核病毒,CONTRA,病毒属 埃及伊蚊浓核病毒,.,第三类病毒是具有双链RNA基因的病毒。呼肠孤病毒、传染性法氏囊病毒（IBD)为其代表。,这类病毒由其不对称地转录出mRNA。病毒核酸由疏松相连的10段双链RNA组成，外被双层衣壳。脱壳时，病毒粒子的外层衣壳由细胞酶除去，结果留下内层衣壳、双链RNA和依赖RNA的RNA聚合酶，由之转录出单链RNA。单链RNA在大小上与各基因组片段相等。母代双链RNA此时完全保留下来。新合成的单链RNA大多直接作为mRNA，另一些则作为合成子代RNA的模板，合成相补的RNA链，结果形成一个新的双链RNA。,.,dsRNA,病毒包括：,1,、呼肠孤病毒科,(Reoviridae),正呼肠病毒属 呼肠病毒,3,型,环状病毒属 蓝舌病毒、非洲马瘟病毒,轮状病毒属 猪轮状病毒,COLTI,病毒属 科罗拉多蜱传热病毒,水生呼肠病毒属 草鱼出血热病毒,质型多角体病毒属家蚕质型多角体病毒,1,型,2,、双,RNA,病毒科,(Birnaviridae),水双,RNA,病毒属 传染性胰脏坏死病毒,禽双,RNA,病毒属 传染性法氏囊病病毒,昆虫双,RNA,病毒属 果蝇,X,病毒,.,第四类病毒是具有单链RNA基因的病毒。包括小RNA病毒和披膜病毒。,这类病毒母代RNA可以直接呈现mRNA的作用，同时又是合成相补(负链)RNA的模板。负链RNA又反过来复制子代RNA。依赖RNA的RNA聚合酶的合成，早于病毒RNA的合成，且不结合于病毒粒子。,某些负链RNA产生既有单链RNA又有双链RNA性质的中间体，这是由于同时形成大量正链的缘故。中间体进而形成完全相同于母代RNA的子代单链RNA。子代RNA又呈现mRNA的作用，从而产生更多的病毒蛋白，同时又作为模板，产生更多的中间体，形成子代RNA,。,由这些病毒抽提出来的,RNA，具有感染性，并且可被腺苷化，在细胞中则可能起mRNA的作用。,.,ssRNA(+),病毒包括：,1,、小,RNA,病毒科,(Picornaviridae),肠道病毒属 猪水疱病病毒、猪传染性脑脊,髓炎病毒、鸭肝炎病毒、,鸡传染性脑脊髓炎病毒、,小鼠脊髓灰质炎病毒,鼻病毒属 牛鼻病毒和马鼻病毒,甲肝病毒属 人甲型肝炎病毒,心病毒属 脑心肌炎病毒,口蹄疫病毒属 口蹄疫病毒,O,型,2,、杯状病毒科,(Caliciviridae),杯状病毒属 猪水疱疹病毒、猫杯状病毒、,兔出血症病毒,3,、星状病毒科,(Astroviridae),4,、,T4,病毒科,(Tetraviridae),.,5,、冠状病毒科,(Coronaviridae),冠状病毒属,I BV,、,TGEV,、,PEDV,等,凸隆病毒属 伯尔尼病毒,6,、未确定科,动脉炎病毒属 马动脉炎病毒,7,、黄病毒科,(Flaviviridae),黄病毒属,JEV,、火鸡脑膜炎病毒,瘟病毒属,CSFV,、牛病毒性腹泻病毒,“类丙型肝炎病毒属”丙型肝炎病毒,8,、披膜病毒科,(Togaviridae),甲病毒属 东（西）方型马脑炎病毒、盖他病毒,风疹病毒属 风疹病毒,动脉炎病毒属 马动脉炎病毒、,PRRSV,等,.,第五类病毒是具有单链RNA基因的病毒，这里病毒母代RNA不能直接呈现mRNA的作用。根据惯例，这种不带译制病毒蛋白信息的RNA，称为负链。借助结合于病毒粒子上的依赖RNA的RNA聚合酶产生正链的RNA，后者呈现mRNA的作用。这类病毒包括副粘病毒、弹状病毒和正粘病毒(流感病毒可能是正粘病毒中唯一具有转录酶活性的病毒)。沙粒病毒和布尼病毒也属负链病毒。,.,上,述病毒的特征是mRNA与病毒RNA相补，即形成与病毒RNA相补的正链RNA。正链RNA呈现mRNA的作用，或者作为模板产生负链子代RNA。其间也可能形成中间体。,病毒螺旋状核衣壳上结合有转录酶。当病毒脱去囊膜后，转录酶立即合成以RNA为模板的单顺反子mRNA。,.,ssRNA(-),病毒包括：,1,、副粘病毒科,(Paramyxoviridae),1.1,副粘病毒亚科,(Paramyxovirinae),副粘病毒属 人副流感病毒,1,型、,鸡新城疫病毒,麻疹病毒属 麻疹病毒、犬瘟热病毒,腮腺炎病毒属 腮腺炎病毒,1.2,肺病毒亚科,(Pneumovirinae),肺病毒属 人呼吸道合胞体病毒,2,、弹状病毒科,(Rhabdoviridae),水泡病毒属 水泡性口炎病毒,狂犬病毒属 狂犬病病毒,暂时热病毒属 牛暂时热病毒,3,、丝状病毒科,(Filoviridae),丝状病毒属 马尔堡病毒,.,4、正粘病毒科(Orthomyxoviridae),甲/乙型流感病毒属 甲型流感病毒,丙型流感病毒属 丙型流感病毒,“类托高土病毒属”托高土病毒,5、布尼病毒科(Bunyaviridae),布尼病毒属 布尼安威拉病毒,汉塔病毒属 流行性出血热病毒,内罗病毒属 内罗毕绵羊病病毒,白蛉热病毒属 西西里白蛉热病毒,6、沙粒病毒科(Arenaviridae),沙粒病毒属 淋巴脉络丛脑膜炎病毒,.,第六类病毒是具有单链RNA基因的病毒，包括白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等许多反转录病毒。,这类病毒在复制过程中，以病毒RNA为模板，在反转录酶的作用下，反转录生成双链DNA中间体，双链DNA整合于细胞基因组DNA中。子代RNA由整合的病毒DNA转 录而来。母代和子代RNA都能呈现mRNA的作用。,.,RNA反转录病毒：,反转录病毒科(Retroviridae),“哺乳动物B型反转录病毒属”小鼠乳腺瘤病毒,“哺乳动物C型反转录病毒属”鼠白血病病毒,“禽C型反转录病毒属”禽白血病病毒毒,“D型反转录病毒属”Mason-Pfizer猴病毒,“BLV-HTLV反转录病毒属”牛白血病病毒,慢病毒属 人免疫缺陷病毒1型,泡沫病毒属 人泡沫病毒,.,附：DNA反转录病毒,：,嗜肝病毒科(Hepadnaviridae),正嗜肝DNA病毒属 乙型肝炎病毒,禽嗜肝DNA病毒属 鸭乙型肝炎病毒,.,第七类病毒是具有双链环状DNA基因的病毒，其中含有部分单链区，单链区长度不等，短链为正链，长度为整个基因组长度(3.2kb)的50%100%，如嗜肝DNA病毒。,这类病毒复制时首先经补链作用成为共价闭环的双链DNA，在核内转录出RNA，其中有前基因组RNA，作为复制的模板，经反转录合成DNA(-)链，RNA随之被RNaseH降解，再以负链为模板合成正链DNA,。,.,第二节 动物常见病毒的分子结构,一乙脑病毒的基因组结构,1.1,病毒的结构：,JEV,病毒颗粒为球形，有包膜，,12,面立体对称结构，直径约,40nm,；与所有的黄病毒一样，,JEV,由脂蛋白外膜包裹着核心蛋白和,llkb,的单股正链,RNA,，其基因组包括,5,和,3,非编码区，单一阅读框编码,3,种结构蛋白：衣壳蛋白,(C),、膜,M,蛋白,(M),和外膜糖蛋白,(E),，以及,7,种非结构蛋白,(NS1,NS5),。,.,病毒的结构蛋白和非结构蛋白:,蛋白质是病毒的另一类主要成分，包括结构蛋白和非结构蛋白。,结构蛋白是指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，包括壳体蛋白、包膜蛋白和毒粒酶等。,病毒的非结构蛋白是指由病毒基因组编码的，在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能，但不结合于病毒颗粒中的蛋白质。,.,其中C蛋白可以保护基因组免受核酸酶及其它因素的破坏；M蛋白参与病毒囊膜的构成并与病毒感染性有关；E蛋白有较多的部分游离于跨膜区外，构成了JEV病毒颗粒表面突出物，E蛋白是病毒的主要抗原成分，具有刺激机体产生特异性中和抗体和凝集红细胞（即血凝素）的活性。一般认为它是病毒受体的结合蛋白，并介导膜融合和细胞穿入。很多证据表明E蛋白在病毒毒力中起重要作用，该蛋白有些关键的单一氨基酸的替代就可引起神经毒力和侵袭力丧失。M蛋白和C蛋白虽然也有抗原性，但在病毒分类及病毒致病机制等方面不起主要作用。,.,1.2,病毒基因组的结构,:,JEV,病毒整个基因组由,5,端非编码区（,5-NCR,）和一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框（,ORF,）和,3,端非编码（,3-NCR,）构成，无亚基因组结构。,ORF,大小约,10.3Kb,编码,3,个结构蛋白：,C,蛋白（衣壳,/,核心蛋白）、,PrM/M,（膜前体蛋白,/,膜蛋白）和,E,蛋白（囊膜糖蛋白）以及,7,个非结构蛋白（,NSl,、,NS2a,、,NS2b,、,NS3,、,NS4a,、,NS4b,、,NS5,）,.,各基因在基因组上的排列为,:5-C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3,它们之间无重叠,(,如下图所示,),JEV,病毒本身具有感染性,其基因组能够作为合成蛋白质的,mRNA,。,.,图,:JEV,基因结构示意图,.,JEV,基因组,cDNA,的核苷酸序列分析表明：病毒基因组,RNA,只含有一个长的开放读码框架,(ORF,）,除去,5,末端的,95,个核苷酸和,3,末端,585,个核苷酸为非编码区外,从位于基因组,5,末端第,96,位的蛋白翻译起始密码子,AUG,开始形成一个含有,10296,个核苷酸，编码容量为,3432,个氨基酸的,ORF,。,.,JEV,病毒基因组,RNA,分子的,5,末端由一,I,型帽子结构，即,m7G(5)ppp(5)ApUp,其中与,5,5-,三磷酸基团相连的腺嘌呤核苷酸上的核糖未被甲基化。病毒,RNA,分子的,3,末端为,CU,OH,，不含多聚腺苷酸,(polyA),尾。在病毒,RNA,分子的,3,末端由,90,个核苷酸组成的二级结构区域的上游，有,3,个十分保守的区域，即,CS1,（含有,26,个核苷酸）和两个,CS2,（含有,24,个核苷酸），这个发夹结构可能是病毒编码的复制酶特异性识别和结合的部位，具有启动子样的功能,在病毒,RNA,的复制和包装中可能起重要作用。,.,分子流行病学研究表明:JEV病毒可分为多个基因型，一般情况下,同一地区流行的病毒株多属于相同的基因型,且基因组核酸序列的同源性相对较高,JEV病毒的基因型分布具有流行病学意义。,.,1.3 病毒结构基因编码的蛋白:,JEV病毒蛋白的合成主要是在宿主细胞的多聚核糖体的粗面内质网上进行，新合成的基因组RNA作为mRNA，从靠近5末端第96位的起始密码子AUG编码蛋氨酸（Met,M)开始，首先合成380ku的多聚蛋白分子，该多聚蛋白分子包括了 C、PreM(M)、E、NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b和NS5共十个病毒蛋白。再经蛋白水解酶的切割加工，产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白。,.,结构蛋白是病毒粒子的主要成分，也是维持形态结构的主要物质，结构蛋白包括衣壳蛋白,C,、毒粒包膜蛋白,M,（由,PreM,切割而来）和,E,；非结构蛋白则有,NS1,、,NS2a,、,NS2b,、,NS3,、,NS4a,、,NS4b,和,NS5,等。尽管尚未证明,JEV,病毒多聚蛋白分子的存在，但根据蛋白氨基酸序列的分析可以发现一整套合理的蛋白酶切位点，现已证实,JEV,共有,7,中非结构蛋白，它们是酶或调节蛋白，与病毒复制、生物合成和病毒粒子的组装和释放密切相关，这些切割位点分为以下三类：,.,（1）在起始的甲硫氨酸残基（Met）之后切割，C蛋白的N末端(5)就是在切割Met后形成的。,（2）在丝氨酸残基（Ser)、丙氨酸残基(Ala)或其它侧短链的的氨基酸残之后切割，这个切割过程可能由宿主细胞内质内膜信号酶来完成，在多聚蛋白前体分子的翻译过程中,核壳蛋白C、PreM、E和NS1利用其一系列的疏水性片段识别并插入内质网膜，逐个完成切割过程。,（3）在两个碱性氨酸残基之后进行切割，这可能由病毒编码的酶或宿主高尔基体的酶类来完成的，这种切割方式可能涉及NS3和NS5蛋白及属于晚期加工过程的M蛋白的成熟。,.,C,蛋白：,由,136,个氨基酸组成，分子量,13ku,位于第一个,AUC,起始的单一,ORF,的,N,末端，首先由氨肽酶切除大分子前体蛋白第一个甲硫氨酸残基,(Met),形成,C,蛋白，在合成部位由,C,端疏水性氨基酸将其暂时固定在粗面内质网上,以便装配成衣壳,用来包装基因组。富含赖氨酸,(Lys),和精氨酸,(Arg)(,约,23%,25%,）所带的正电荷在形成壳体时，所带的正电荷在装配形成衣壳时可与基因组相互作用中和核酸所带的负电荷。,.,C蛋白的第3954氨基酸序列在黄病毒中具有保守性，JEV与WNV、YFV的同源性分别为75%和50%，WNV和YFV的同源性为44%，且该段氨基酸序列具有疏水性。C蛋白的作用是在合成部位由C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上,以便装配成核衣壳包裹基因组,保护基因组免受核酸酶或其它因素的破坏。,.,M 蛋白,：,是第二个被编码的蛋白,由75个氨基酸组成，分子量约8.5ku,该蛋白存在于成熟的病毒粒子中，是在病毒粒子成熟的过程中由前体糖蛋白PrM切割而来。PrM带有N-连接的糖侧链,具有Asn(天冬酰胺）-X-Thr（苏氨酸）序列的糖基化位点，PrM的C末端是2个Arg残基,可能被高尔基体中的细胞蛋白酶识别而催化，使PrM裂解成无糖基的M蛋白，具体的过程还不清楚。在成熟病毒粒子释放之前PrM与E蛋白形成异二聚体，PrM对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配是至关重要的,与膜结合以及装配所必需的,可认为PrM蛋白是一种分子伴侣。M蛋白还协同E蛋白诱生中和抗体和保护免疫反应,也可能具有分类学上的意义。在病毒粒子释放同时或释放之前一瞬间，PrM切割形成M蛋白，该切割过程可能由细胞转运小泡内的蛋白酶完成。,.,M,蛋白是完全疏水的，参与病毒囊膜的构成，是病毒囊膜主要结构成分之一,被包埋在囊膜的脂质双层中,它可能与插入脂双层的,E,蛋白完全疏水性,C,端相互作用，,M,蛋白对维持,E,蛋白空间结构是必须的。,Takegami,等,x,对其生物学功能进行了研究,认为,M,蛋白参与病毒的感染过程,PrM,是病毒诱发保护性免疫的重要协同成份,M,能诱生具有轻度中和作用的抗体。,.,E蛋白：,在黄病毒中,E蛋白为JEV主要结构蛋白,得到广泛的研究，E蛋白的分子量为53kD，含500个氨基酸残基，富含甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)，脯氨酸(Pro)含量最低，不同基因型的毒株，某些氨基酸的含量也不同。目前对E蛋白的一级结构了解较多，已测定N末端氨基酸序列为：Phe（苯丙）-Asn（天冬酰胺）-x-Leu（亮）-Met（蛋）-Gly（甘）-Val（缬）-Phe（苯丙）-Ile(异亮）-。E蛋白带有N-连接的糖侧链显示两性分子的特性，最大的两性分子区之一是420455位残基之间。,.,E,是含有高甘露寡糖的糖蛋白，糖基化位点在,Asn,（天冬酰胺）,-X-Ser,（丝氨酸）（,448,450,）的,Asn,上，该位点在大多数黄病毒中是保守的。糖侧链的存在对病毒蛋白抗原性有重要影响，当病毒基因组翻译成多肽后，经信号肽酶裂解，在粗面内质网中合成，装配成,E,多肽骨架，到滑面内质网加上糖链,使之形成带有糖链的,E,蛋白。,.,E,蛋白,C,末端是疏水的，和脂双层膜疏水基团相互作用于而结合在囊膜上，然后插入，并包埋在脂双层膜内，成为通透屏障，使病毒外部糖蛋白和内部核心成分相互作用,并维持结构的稳定性,带有高甘露糖寡糖侧链的,N,末端伸出囊膜外组成囊膜子粒的穗状物（,spikes),使病毒具有形态特征。,.,E,蛋白是主要囊膜蛋白，也是毒粒表面的重要成分，由它形成抗原决定簇，并参与,JEV,的许多重要生物学过程，如病毒装配、结合受体以及与膜结合，并且是体外中和作用的主要靶位点和,JEV,特异性抗体的作用位点。具有血凝活性和中和活性，能和血凝抑制抗体结合，能剌激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。与病毒的吸附、穿入、致病和诱导机体宿主的免疫应答作用密切相关，所以人历来把研究的重点放在蛋白,E,上，现已深入到高级结构，这将为基础研究和临床应用以及亚单位或基因工程疫苗提供了分子水平的依据。,.,研究结果表明：,E,蛋白上,E138,和,E176,位点上氨基酸乙脑的减毒过程中起了重要作用，其中,E138,的突变引起,E,蛋白的二级结构的变化，这两个位点氨基酸突变可能改变了,E,蛋白对细胞受体的吸附性，或者引起该病毒对其他细胞不可穿透，这两种机理导致病毒毒力减弱，,E,蛋白,138,位点或,138,和,176,位点一起对乙脑病毒强毒株在连续传代过程中减弱起了关键作用。,.,，高株和中山株不能被,51-8McAb,所中和，,A2,株介于两者之间；用寡核酸指纹图谱也表明，高株比,A2,多两个斑点，但大多数是一样 陈伯权等用多克隆抗体进行分析时，我国分离到的乙脑病毒,SA14,、,P3,、,A2,和高株无明显差别，与日本分离到的中山株有些差别，用单克隆抗体进行分析，,SA14,和,P3,抗原相似。,.,NS1蛋白：,由大约350个氨基酸组成，是一种分泌型糖蛋白,含高甘露糖寡糖基团，致使NS1蛋白的分子量从40Ku上升到46Ku。但由于在130位和207位存在N-连接糖链,在感染细胞内其实际分子量为46ku左右。在哺乳动物细胞的感染过程中NS1蛋白是以膜结合的微粒子形式从感染细胞释放的，同时还以可溶性蛋白的形式存在，在感染的细胞表面也存在NS1蛋白。,.,Mason等（1987）由大肠杆菌来表达JEV抗原，证实在JEV感染的细胞中NS1蛋白以NS1和NS1两种形式存在，NS1和NS1在N 末端具有相同的序列，该段序列由基因组的NS2A基因编码，使NS1蛋白存在于细胞表面成为可能。NS1分子量为40kD，NS1分子量为58ku。由于NS1和NS1存在相同的N末端，故有相同的抗原性和生化特性；NS1是主要的病毒产物，而不是在NS1产生过程中短暂存在的。在细胞培养液中NS1的量大，可能是因为NS1比NS1更有效地分泌到细胞外或NS1在释放过程中被降解为NS1。NS1蛋白特异性免疫探针与JEV感染细胞结合结果，说明分泌于感染细胞表面;另外，感染细胞还分泌可溶性的NS1。,.,Mason,等,(1987,）在,TritionX-100,存在的情况下通过超速离心发现,NS1,蛋白的沉降特征的改变，说明,NS1,蛋白与膜相互作用结合在一起。,NS1,是一种与膜功能相关的糖蛋白,其具体功能还不清,但认为参与病毒复制的早期阶段,.NS1,还可能参与病毒组装和释放,是主要的抗原成分之一,由于,NS1,蛋白不组成毒粒,所以没有中和活性和血凝活性，但它具有可溶性补体结合活性，它在感染细胞表面，成为杀伤感染的靶子，因此它可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力，即诱生非中和性保护力，且不产生抗体依赖性增强，加之,NSI,的基因和表型具有高度同源性，因此它可作为具有广泛作用的亚单位疫苗研制的绝好材料。,.,在,JEV,感染的单层细胞和细胞液中存在包含,NS1,和,NS1,的二聚体，该二聚体耐,SDS,，但对热极敏感。,Flamand,等（,1992,）用重组杆状病毒表达,NS1,，发现当,NS1,组合形成二聚体时可与膜相互作用，细胞外的,NS1,二聚体自由存在或与膜相互作用形成复合物。,Winker,等证明,NS1,以二聚体形式出现是黄病毒感染的一个特点。在感染细胞的内质网和高尔基体内，,NS1,和,E,共同滞留一段时间，这就为,NS1,在毒粒形成中起一定作用提供了证据。,.,NS2蛋白：,JEV非结构蛋白NS2由其基因组NS2区编码，NS2蛋白还可被进一步加工成两个成熟的非结构蛋白NS2a和NS2b，NS2a分子量约为17ku,NS2b约为13ku,均为疏水性蛋白,在所有黄病毒中其同源性最低，目前有关NS2蛋白的功能了解得还不很清楚，NS2蛋白可能与膜功能有关。,.,NS3 蛋白：,分子量为64ku,非结构蛋白NS3是黄病毒科病毒非结构蛋白中研究的比较多，对其功能也是了解得比较清楚的一种非结构蛋白，其C末端和N末端的氨基酸组成已研究清楚,具有亲水性基团,它不仅在病毒RNA复制和多聚蛋白加工过程中具有重要的作用，而且在病毒与宿主细胞的相互作用中似乎也扮演了一个十分重要的角色。,.,人们通过体外表达,NS3,蛋白，建立体外非细胞反式切割分析体系，证实了,NS3,蛋白是一个具有三种酶活性的多功能蛋白：具有丝氨酸蛋白酶活性,(serine protease),、核苷三磷酸酶活性,(nucleoside triphosphatase,，,NTPase),、,RNA,解旋酶活性,(RNA helicase),，,NS3,蛋白的丝氨酸蛋白酶及其核苷三磷酸酶解旋酶活性分别位于其,N,端的,1,3,区和,C,端的,2,3,区，在,NS3,蛋白多肽上处于两个相对独立的功能区，其丝氨酸蛋白酶的关键催化残基,Ser,的突变可致蛋白酶活性丧失，但仍具有,ATPase,活性，前者主要负责病毒多聚蛋白的翻译后加工，产生成熟的病毒蛋白，这是病毒自我复制和组装的前提条件。,.,TPasehelicase则主要参与病毒RNA的复制过程，分子量为70ku，在病毒繁殖和复制过程中扮演重要的角色，非常保守，具有三种酶的活性，其氨基端结构域具有丝氨酸蛋白酶超家族成员的结构，能够在连续两个非氨基酸残基和与之相邻的带有短的侧链的氨基酸残基间切割蛋白。,Takegami等认为NS3蛋白是一个具有激酶和解旋酶特性的多功能蛋白,用在E.coli.上表达的NS3融和蛋白免疫得到的抗血清进行的Western-blot分析表明：NS3蛋白主要存于JEV感染的细胞膜上。,.,wang,等,(,等,(1998),研究发现,NS3,主要存在于感染鼠大脑锥体神经元和小脑分子颗粒层,(Molecular and granular layers),。交叉免疫试验表明,NS3,是最主要的交叉反应蛋白。在体外加入,NS3,抗血清可降低,JEV RNA,的合成，,NS3,蛋白还具有与,RNA,结合及,ATP,活性。,Jan,等,(1995),和,Chen,等,(1997),研究了,JEV 3-NCR,与,NS3,蛋白和,NS5,蛋白的相互作用，发现,NS3,和,NS5,在体内相互作用形成蛋白,-,蛋白复合物，继而与,3-NCR,的茎环结构形成复制复合体参与负链,RNA,的合成。可见，,NS3,蛋白在病毒感染细胞中对病毒,RNA,的复制具有十分重要的功能。,.,NS4,蛋白：,NS4a,和,NS4b,是黄病毒科病毒基因组,NS4,区编码的两个成熟的蛋白多肽，多聚蛋白产生后在,NS3,蛋白酶的作用下水解产生，目前对,NS4b,的功能并不十分清楚，但已发现,HCV,的,NS4a,在病毒复制中，多聚蛋白翻译后加工过程中具有十分重要的作用。,NS4a,蛋白不仅在多聚蛋白前体的水解过程中扮演了十分重要的角色，同时,NS4a,在,NS5a,蛋白的成熟过程中发挥着重要作用。,.,NS5蛋白：,分子量为10,5,ku,在黄病毒中其氨基酸序列同源性最高,JEV与WNV为82%,JEV与YFV为60%,WNV与YFV为61%，包括JEV在内的几种不同RNA病毒聚合酶共有的序列Gly(甘）-Asp（天冬）-Asp（天冬）(GDD)，这个同源序列存在于多种正链RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶中，据此推测：NS5为一个参与病毒复制的依赖于RNA的RNA聚合酶，即病毒复制酶。现已证实黄病毒中一些病毒，如DEN、HCV、JEV等的NS5依赖于RNA的RNA聚合酶活性。Rice等在1985年提出了NS5蛋白可能参与病毒RNA聚合酶的组成。Edward 和Takegami(1993)以及余福勋等(1998)的研究也揭示了NS5蛋白的这一潜在功能。,总之，对于非结构蛋白的结构和功能有待进一步的研究。,.,