普通PCR及测序PCR原理分解.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一,PCR,技术,1,PCR,概念,PCR,的原理,PCR,中的注意事项,PCR,的主要类型,2,什么是,PCR?,多聚酶链式反应,(,p,olymerase,c,hain,r,eaction,),简称,技术，是一种在,DNA,聚合酶作用下体外扩增特异片段的技术。,PCR,技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。,80,年代中期,PCR,技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。,3,PCR,反应的几个要素,DNA,聚合酶,生产机器,模板（要扩增的,DNA,）,引物,dNTPs,原料,Buffer,（缓冲液）,稳定的环境,Mg,2+,等,润滑剂,模具,4,72,（延伸）,95,（变性）,50,（退火）,PCR,循环（,25-35,个）,PCR,反应步骤,5,模板,DNA,95,变性,(denaturaion),6,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,退火,(annealing),7,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,延伸,(extension),8,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,9,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,（,1,）,第,1,轮扩增（,2,）,第,2,轮扩增（,4,）,第,3,轮扩增（,8,）,第,4,轮扩增（,16,）,第,5,轮扩增,（,32=2,5,）,10,标准的,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,上下游引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0,.,1,2ug,Taq DNA,聚合酶,2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,11,1,）,PCR,反应成分,（,1）模板,模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR），既可以是双链，也可以是单链。,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。,一般100ng DNA模板/100,L。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR,反应条件,12,（,2,）,Taq,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,DNA,聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、,dNTP,等,存在的情况下催化,DNA,的合成。,Taq,酶来自水生嗜热菌,T,hermus,aq,uaticus,特点：,1.,良好的耐热性,在,70,80,具有最高聚合活性,在,95,仍然可以有,50%,活性,2.Mg2+,依赖性,3.,扩增时,3,末端凸出一个,A,碱基,3.,无校正功能,一般,PCR,中酶的用量为,0.5-2.5 U/50,l,，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应产量。,13,（3）引物,引物浓度：,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,引物设计：,（1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。,（2）引物长度以15-40 bp为宜。,（3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。,（4）引物Tm在50-65之间，两条引物的,Tm应接近，不能相差太大。,（5）引物内部避免形成二级结构。,14,（6）两引物间避免有互补序列。,（7）引物3端与模板序列要严格配对，3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；引物 5端无严格限制。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列,启动子序列,定点突变,探针标记,15,（,4,）,dNTP,dNTP,：,d,A,TP,，,d,T,TP,，,d,G,TP,，,d,C,TP,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,16,（,5,）,Mg,2+,Mg,2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg,2+,浓度。,17,（,6,）缓冲液（,Buffer,）,10mmol/L TrisHCl,调节,PH,，使,Taq,酶活性作用环境维持在扁碱性（,pH8.3,室温）,50mmol/L KCL,有利于引物的退火，但过高会抑制,Taq,酶活性,0.01%,明胶 保护酶不变性失活,18,2,）循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,95,o,C 20-30,秒,(2),退火,退火温度由引物,Tm,值决定，一般为,Tm,5,10,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,19,（,3,）延伸,70-75,o,C,(,温度取决于聚合酶的活性）,延伸时间由扩增片段长度及,DNA,聚合酶的延伸速度决定,（,4,）循环次数,主要取决于模版,DNA,的浓度,一般为,25-35,次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,20,一个典型,PCR,体系,反应体系（,50,ul,）,：,Taq,酶,2.5 U,10 x Buffer,5,ul,dNTP(2.5mM),4,ul,DNA,模板,0,.,1,2ug,上游引物,(10P),2 ul,下游引物,(10P),2 ul,H,2,O,补足至,50 ul,总计,50 ul,反应流程,（以扩增片段大小为,800bp,为例）：,95 5 min,95 30 s,55 30 s,72 1 min,72 5 min,4 -,30,个循环,21,PCR,的特点,特异性强,灵敏度高,PCR,产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克,(pg=10,-12,),量级的起始待测模板扩增到微克,(,g=10,-6,),水平,简便、快速,PCR,反应一般在,2,4,小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,22,4.,对标本的纯度要求低,：,不需要分离病毒或细菌及培养细胞，,DNA,粗制品及总,RNA,均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的,DNA,扩增检测,23,PCR,常见问题,假阴性，无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,24,无扩增产物,模板,:,含有抑制物，含量低,Buffer,对样品不合适,引物设计不当或者发生降解,反应条件：,退火温度太高，延伸时间太短,原因,对,策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板,DNA,或加大模板的用量,更换,Buffer,或调整浓度,重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物,降低退火温度、延长延伸时间,现象：,正对照有条带，而样品则无,；,25,非特异性扩增,现象：,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,26,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,循环次数过多,原因,对,策,重新设计引物或者使用巢式,PCR,适当降低模板或引物浓度,适当减少酶量,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,减少循环次数,非特异性扩增,27,拖尾,现象：,产物在凝胶上呈,Smear,状态,。,M 1 2,28,模板不纯,Buffer,不合适,退火温度偏低,酶量过多,dNTP,、,Mg,2+,浓度偏高,循环次数过多,原因,对,策,纯化模板,更换,Buffer,适当提高退火温度,适量用酶,适当降低,dNTP,和镁离子的浓度,减少循环次数,拖尾,29,假阳性,（筛选转基因、检测基因表达情况,),原因：,靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：,空白对照出现目的扩增产物,对策：,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；,除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。,各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,30,（一）防止污染,试剂小量分装,吸头及,EP,管一次性使用,器皿及工作区域要分开，无菌操作,（二）设立对照,阳性对照：阳性模板,阴性对照：阴性模板,试剂对照：除模板外的所有组分,注意的事项,：,31,PCR,的类型及应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,32,PCR,的不同类型,重组,PCR,不对称,PCR,反向,PCR,多重,PCR,原位,PCR,连接酶链反应,巢式,PCR,递减,PCR,热启动,PCR,RT,PCR,实时定量,PCR,33,重组,PCR,（基因克隆）,重组,DNA,质粒,DNA,基因片段,34,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,35,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,CCTG,GGAC,GTCC,CAGG,质粒,DNA,目的基因,限制性核酸内切酶,36,不对称,PCR,目的：扩增产生特异长度的单链,DNA,。,方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。,用途：制备核酸序列测定的模板,制备杂交探针,基因组,DNA,结构功能的研究,37,高浓度引物,低浓度引物,38,反向,PCR(reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的,DNA,片段对某个已知,DNA,片段两侧的未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知,DNA,片段的序列；用于仅知部分序列的全长,cDNA,的克隆,扩增基因文库的插入,DNA,；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,39,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,40,多重,PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,41,原位,原位聚合酶链式反应（,In Still PCR,，,Is,PCR,）是由,Haase,等于,1990,年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,42,操作步骤,固定组织或细胞,:,将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶,.,蛋白酶,K,消化处理,:,用,60ug/ml,的蛋白酶,K,将固定好的组织细胞片,55,消化处理,2h,后，,962min,以灭活蛋白酶,K.,PCR,扩增,:,在组织细胞片上，加,PCR,反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行,PCR,循环扩增,.,有的基因扩增仪带有专门用于原位,PCR,的装置,.,杂交,:,PCR,扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交,43,原位,PCR,的作用,既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（,ISH,），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于,10,的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的,PCR,则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。,ISPCR,则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内,RNA,表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,44,人类染色体端粒,DNA,的荧光原位杂交照片,45,LCR,连接酶链反应,LCR,（,Ligase chain reaction,）基本原理为利用,DNA,连接酶,.,特异地将双链,DNA,片段连接，经变性,-,退火,-,连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增,.,若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物,.,46,47,LCR,的引物是两对分别互补的引物，引物长度为,20,26,个，以保证引物与靶序列的特异性结合，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性,.LCR,连接反应温度接近寡苷酸的解链温度,(Tm),，因而识别单核苷酸错配的特异性极高,.LCR,的扩增效率与,PCR,相当，用耐热连接酶做,LCR,只用两个温度循环，,94min,变性和,65,复性并连接，循环,30,次左右,.,目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等,.,48,LP,（,Labelled primers),检测,利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。,特别适合大量临床标本的基因诊断,可同时检测多种基因成分,病毒,1,病毒,2,病毒,3,病毒,4,49,标记引物,观察,PCR,产物,50,巢式,PCR,（,Nest-PCR,）,P,1,P,2,P,3,P,4,巢式,PCR,的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式,PCR,可以增加有限量靶序列,（,如稀有,mRNA,）,的灵敏度，并且提高了困难,PCR,（,如,5 RACE,）的特异性。,51,递减,PCR,（,TouchDown PCR,）,递减,PCR,通过在,PCR,的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的,Tm,高大约,5,的退火温度下开始，然后每个循环降低,1,-,2,直到退火温度低于,Tm,5,。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减,PCR,对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如,AFLP,、,DNA,指纹分析等。,52,热启动,PCR,（,HotStart PCR,）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟,DNA,合成，直到,PCR,仪达到变性温度；,现在有很多公司都有,HotStart Taq,酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用,；,热启动,PCR,是除了好的引物设计之外，提高,PCR,特异性最重要的方法之一。,53,RT-PCR,RNA,的多聚酶反应（,RT-PCR,）是以,RNA,为模板，联合逆转录反应（,r,everse,t,ranscription,，,RT,）与,PCR,，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于,10,个拷贝的,RNA,模板,。,RNA,扩增步骤：,在,单引物,的介导下和,逆转录酶,的催化下，合成,RNA,的互补,cDNA,加热后,cDNA,与,RNA,链解离，然后与另一引物退火，并由,DNA,聚合酶,催化引物延伸生成双链靶,DNA,最后扩增靶,DNA,RT-PCR,54,逆转录酶,聚合酶,RNA,杂合双链,PCR,扩增,RNA,cDNA,反转录引物,55,逆转录酶：,禽类成髓细胞病毒,(AMV),逆转录酶，活性包括依赖于,RNA,的,DNA,合成，依赖于,DNA,的,DNA,合成以及对,DNA:RNA,杂交体的,RNA,部分进行内切降解,(RNA,酶,H,活性,),。,鼠白血病病毒,(MLV),反转录酶。,MLV,反转录酶兼备依赖于,RNA,和依赖于,DNA,的,DNA,合成活性，但降解,RNADNA,杂交体中的,RNA,的能力较弱。,普通逆转录酶反应温度为,37-42,度，所以反转录的延伸温度一般都是,37,或,42,。,56,逆转录反应的一般步骤,RNA,模板,+,反转录引物，,70,，,5min,冰浴,1min,。,再加以下反应组分：,Buffer,dNTP,逆转录酶抑制剂,逆转录酶,以上组分加好后，混匀，,42,或,37 60min,。,70,，,5min,后再冰浴，所得产物就是,cDNA,，,cDNA,用做后面的,PCR,的模板。,57,一步法：,利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、,Taq,酶、,4,种,dNTP,直接进行,mRNA,反转录与,PCR,扩增。发现,Taq,酶不仅具有,DNA,多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以,mRNA,为模板进行反转录和其后,PCR,扩增，从而使,mRNA,的,PCR,步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总,RNA,中小于,1ng,的低丰度,mRNA,。该法可用于低丰度,mRNA,的,cDNA,文库的构建及特异,cDNA,的克隆，并有可能与,Taq,酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。,58,两步法：,由于单管反应时,RT,和,PCR,都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量,PCR,。两步法则是将,RT,和,PCR,分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些,GC,含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的,RT-PCR,。,59,二、测序原理,双脱氧核苷酸终止测序法（也叫,sanger,测序法）的原理是：在,PCR,体系中加入双脱氧核苷酸（,ddNTP,），在,PCR,延伸过程中,ddNTP,随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的,PCR,反应，生成一系列长度相差,1,个碱基,的,PCR,产物混合物，此产物通过电泳根据不同长度片段的电泳速度不同来检测整段,DNA,的序列。,60,dNTP,与,d,dNTP,61,双脱氧终止法示意,普通dNTP,3端羟基,在聚合酶作用下与下一碱基5端磷酸基团结合形成磷酸二酯键，DNA链得以延伸,ddNTP被去掉,3端羟基,，无法,与,后继的dNTP结合形成磷酸二酯键，所以DNA链被终止,62,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,OH,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,双脱氧终止法示意,脱氧核苷酸,（,dNTP,）,的连接,63,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,OH,O,碱基,C,P,O,H,1,2,3,4,5,H,DNA,聚合酶,双脱氧终止法示意,脱氧核苷酸（,dNTP,）的连接,64,O,碱基,C,P,H,1,2,3,4,5,H,DNA,聚合酶,双脱氧终止法,示意,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,OH,双脱氧核苷酸（,ddNTP,）,65,双脱氧终止法测序反应组分,模板,预备测序的双链或单链,DNA,引物,在模板上已知区域设计的测序引物，引物确定了测序的,方向,和,位置,dNTP,ddNTP,脱去,3,端羟基的,dNTP,，并且,4,种不同的,ddNTP,上标记有,4,种不同颜色的荧光标记,DNA,聚合酶,缓冲液,为,DNA,聚合酶提供工作条件,66,模板,引物,DNA,聚合酶,测序组分示意图,因为,颜色,不同，,4,种终止物可以在一起进行反应。,67,测序反应示意图,在引物延伸反应过程中，,dNTP,和,ddNTP,是,相互竞争,地掺入到延伸链的,3,端的，因而,ddNTP,在不同位置掺入，就产生了一系列不同长度的新的,DNA,片段。,68,测序,PCR,产物电泳分离示意图,69,不同片段长度的测序产物因大小不同而电泳速度不同，从小到大先后通过测序仪的荧光检测窗口，并根据检测的荧光信号颜色来读取通过片段的末端的碱基序列，一系列相差,1,个,碱基的片段依次通过，则就可以读出整个模板片段的序列。,70,测序仪基本构造示意图,71,72,73,1,电进样及电泳,1.,毛细管和电极,深入样品溶液中,2.加电压,3.荷负电的DNA分子进入毛细管,在电场作用下向阳极泳动,74,2,荧光激发和检测,分别带,4,色荧光标记的,DNA,片段,从小到大依次经过激光检测区,2.,激光激发荧光,产生长波长的荧光信号,3.,荧光信号被冷,CCD,收集,4.,软件将光学信号转换成电泳图谱,75,76,PCR,扩增与,DNA,测序反应的区别,类型,PCR,测序反应,PCR,产物增加方式,指数,线性,模板量,少,多,引物,一对,一个,dNTP,有,有,ddNTP,无,有，带荧光标记,酶,Taq,酶,测序酶（,T7 DNA,聚合酶）,退火温度,根据引物退火温度而定,50,度,退火时间,根据片段大小而定,固定,延伸温度,72,度,60,度,延伸时间,根据片段大小而定,固定,产物大小,长度一致,相差一个碱基的一系列片段,76,