COS7细胞冻存和复苏传代培养.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,COS7,细胞冻存和复苏传代培养,1,研究目的,建立,CoS-7,细胞培养的方法,观察,COS,7,细胞培养的特点,了解,COS,7,细胞的用途,2,建立,CoS-7,细胞培养的方法,主要阐述,CoS-7,细胞培养的体系,3,观察,COS,7,细胞培养的特点,是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过程中形态的变化，分裂生长的形式等,4,了解,COS,7,细胞的用途,COS-7,细胞的来源、特性及生命医学用途：,5,小结,6,COS7,细胞,(,猴细胞的一种细胞系,),为重组病毒的宿主细胞，是表达,SV40,大,T,抗原的非洲绿猴肾细胞株，能支持部分突变型,SV40,和含,SV40 ori,的质粒载体的复制,可高水平表达外源基因，常作为瞬时表达宿主。故本实验建立,COS7,细胞的冻存和复苏传代方法。,7,（一）实验材料,1,细胞株,cos7,细胞株,2,试剂,RPMI-1640,培养基,小牛血清（,NBS,）,N-(2-,羟乙基,)-,哌嗪,-Ng-2,（丙磺顺酸）（,Hepes,，,Sigma,公司产品）胰蛋白酶,碳酸氢钠以及链霉素和青霉素,3,实验准备,8,1,培养液的配置,1(1)RPMI-1640,液：,1640,粉,2,袋,Hepes 2.14g,碳酸氢钠,4.0g,加水至,2000ml,调至,PH=7.15,，过滤。,1(2)1640,完全培养液：,10,小牛血清双抗（含链霉素、青霉素）的,1640,培养液，,4,保存。,1(3)10%DMSO,冻存液的配置：,1,份,DMSO,3,份小牛血清,6,份完全培养基,1(4),胰蛋白酶,1.25g,EDTA,（乙二胺四乙酸二钠）,0.10g,于烧杯中先用少许,PBS,调成糊状，再补充,PBS,至,500ml,，搅拌混匀,4,小时后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。,9,2 Cos7,细胞冻存方法,2,（,1,）取对数生长期的细胞，收集细胞前换液一次。,2,（,2,）,Cos7,细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，,1200,转,/,分离心,1,分钟，去上清。弹指法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴加入与细胞悬液等量的,DMSO,冻存液。,2,（,3,）分装：细胞悬液分装在,2 ml,冷冻管中，密封后标记细胞名称和冷冻日期。,2,（,4,）梯度降温冻存：冷冻管置,-20,、停留,1,2,小时，再降至,70,过夜，投入液氮。,10,3 Cos7,细胞复苏,3,（,1,）将加有小牛血清双抗的,1640,完全培养液从冰箱取出，升至室温。,3,（,2,）从液氮中取出冻存管，迅速投入,3738,水浴中，摇晃使其在,1,分钟左右融化。,3,（,3,）转至,EP,管，加,1640,完全培养液至,1.5 ml,左右，吹打，,1200,转,/min,，离心,3,分钟。,3,（,4,）去上清，再加,1640,完全培养液至,1.5 ml,左右漂洗，离心,3,分钟。去上清，加新鲜培养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液至总体积约,4ml.,，置温箱培养。,11,4 Cos7,细胞传代,4,（,1,）弃掉培养瓶内原来的培养液，加入,5,7,滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶底，吸出胰蛋白酶。,4,（,2,）再加入,8,10,滴,0.25%,胰蛋白酶，将培养瓶置,37,、,5,CO2,孵箱,2,3min,，观察细胞胞体回缩变圆,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。,4,（,3,）小心吸出并弃去胰酶，加入,1,2ml1640,完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液，,14,传代。各瓶加入培养液,2ml,，放入,37,、,5,CO2,培养箱继续培养。,12,二,结果,1,复苏细胞：第,1d,镜下观察复苏细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第,2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分贴壁。第,3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖速度较快，折光性好。,5d,后可按比例传代。,13,2,传代细胞：第,1d,镜下观察传代细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第,2d,中,传代细胞镜下观察细胞已贴壁,折光性好,少数细胞出现伪足。第,3d,传代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸出伪足,细胞轮廓清楚,折光性强,细胞数量明显增多。,14,3,传代细胞传至第,6,8,代仍保持增殖状态，细胞生长速度未见减慢,能长满瓶底。,15,三,讨论,1,养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难。首先，细胞株在传代中其性质发生变化。其次，在传代中有微生物污染的危险。解决这些困难的办法就是将细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时间几乎是无限的（因为在,-130,以下，所有的生化反应已停止，而液氮的温度在,-150,-160,之间）,16,2,培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大，导致营养不良而引起细胞衰老,停止生长,甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离,稀释,接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环境，以利于细胞的生存和增殖，通常原代细胞按,1,：,2,分种传代，细胞株按,1,：,4,分种传代,17,3,实验需严格遵守无菌操作规则，以减少操作引起的污染。一切操作，都要在火焰周围进行，瓶口、吸管等要经过火焰消毒。但用于吸取细胞培养液、小牛血清、酶液的吸管使用后不能在火焰上消毒，因为残留在吸管中的培养液烧焦炭化，再使用时会把有害炭化物带入培养液中毒害细胞。,18,4,实验完毕，关闭超净台鼓风机和电源，未使用器材放入饭盒内，用过的玻璃器材投入清水中浸泡，用酒精棉球擦拭工作台面。可减少培养液被微生物污染。,19,5,细胞冻存复苏的基本原则是慢冻速融,可最大限度的保存细胞活力。细胞直接冻存时,细胞内外的水分会很快形成冰晶,引起一系列不良反应。因而在冻存时尽可能地减少细胞内水分及冰晶形成,是保护细胞减少损伤的关键。目前多采用甘油和二甲基亚砜（,DMSO,）作保护剂,它们对细胞无明显毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降。通过缓慢冷冻,使细胞内水分尽可能多的渗出细胞外,减少细胞内冰晶形成。而复苏细胞时,采用快速融化,可保证细胞外结晶在很短时间内融化,避免缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶。在本实验中,我们用二甲基亚砜作保护剂,经过两个低温梯度、过夜后移入液氮,;,融化复苏时在,37,、,2,分钟内完成,对细胞未造成明显损伤,复苏后细胞存活率可达,90%,细胞形态、生长速率与未冻存细胞相比,未见明显差异,20,6 cos7,细胞生长分为,3,期：延缓期、增殖期和停滞期,.,首次传代一般在,Cos7,细胞增殖早期,此时细胞刚刚度过延缓期,脆弱易损,首次传代对于,Cos7,细胞是否能长期存活尤为重要,.,而在,Cos7,细胞增殖后期,细胞贴壁紧密,消化时间不足,细胞不易从瓶壁脱落,不仅传代细胞数量少,影响实验的准确性,而且由于局部代谢物的积累,细胞即进入停滞期,若消化时间过长,待细胞完全从瓶壁脱落,则细胞膜已受损,死细胞增多,.,胰蛋白酶是常用的消化液,可使细胞脱离附着物表面和相互离散成单个细胞,但胰蛋白酶对细胞也有损伤可影响细胞活性,5,.,本文建议采用,0.25%,胰蛋白酶在,37,消化,2min,的参数。这是因为在,37,下胰蛋白酶活性最大,所需消化时间最短,可避免胰蛋白酶长时间作用于细胞造成细胞的损失。,21,7,本室探讨了,37,、,CO2,条件为培养,Cos7,细胞的适宜环境。因为刚复苏细胞增殖缓慢,自身调节,pH,的能力差的缘故，显示复苏细胞要在,37,、,5,CO2,条件下培养才能顺利传代并保持较好的生长状态,22,参考文献,1,Gluzman Y.SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.Cell,1981,23,:175,182.,2,Sambrook J,Fristch E F,Maniatis T.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor,NY,1989,3,中山大学中山医学院分子医学研究中心,.,常用细胞生物学试验技术原理,.,分子医学实验技术培训班实验讲义,4,刘耳等，中国畜禽传染病，,1989,，,6,，,45,5,马翠玲,李志强等,胰蛋白酶预处理在人角质形成细胞传代培养中的应用,.,第四军医大学学报,(JFourthMilMedUniv)2001;,22(2),：,177,23,