基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用医学课件.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,2017/11/15 Wednesday,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因修饰技术在人源化肝脏小鼠模型中的应用,早在,17,世纪动物试验就已经出现了。目前试验动物广泛应用于生理学、医学、药学等学科的教学与研究，以及食品、化妆品、生物制品、工业产品等的安全性、毒性和效力等方面的试验和检测，具有重要价值和作用。,试验用动物,种属差异,动物基因组,人类基因组,代谢、免疫相关人类毒性,肝脏是人体最重要的代谢器官，也是出现受试人员中毒时最常见、表现最明显、影响最严重的毒性靶器官,。另据报导，每年临床发生肝毒性损伤的病例亦非常多。药物引发肝损伤占全部中毒事件,20%,50%,，暴发性肝衰竭可达,15%,30%,。,药物性肝损害,非阿尿苷事件回顾,非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物，其前期试验药效显著，结果良好。而,1993,年,15,名受试者加大剂量（,0.1 or 0.25 mg/kg/d),）的二期临床试验中，前,8,周疗效明显，而,13,周时,7,名受试者出现肝衰竭、脾衰竭、乳酸中毒，其中,5,名不治身亡。,动物试验非阿尿苷最大耐受剂量,小鼠,50mg/kg/d,90d,大鼠,500mg/kg/d,30d,比格犬,3mg/kd/d,90d,食蟹猴,25mg/kg/d,30d,小鼠给药剂量达到,250mg/kg/d,（人类剂量,1000,倍）时，,50,只小鼠仅有,4,只死于肾衰竭。大鼠剂量达,510mg/kg/d,（人类剂量,2000,倍），持续给药,70d,，所有大鼠,ALT,、,AST,均正常。,毒性,预测,食品,生物制品,化妆品,药物,试验动物作为预测工具如不能完全准确预测人体可能会出现的情况，就如同战地扫雷，一旦出现误判，,代价,很有可能将是,巨大,的！,危险,安全,那么能不能,构建,一种,临床前更贴近人肝代谢、预测性更一致性的试验动物模型,，,将可能发生的人类肝毒性提前筛查出来，降低无谓成本，减少临床损失,呢？这将,具有极其重大的意义和价值,！,人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点,分子,技术,生物,模型,临床,应用,现代生物医药领域研究模式,基因修饰技术,ES,打靶基因修饰技术,TALEN,基因修饰技术,CRISPR/Cas9,基因修饰技术,TetraOneTM,基因修饰技术,基因修饰动物建模,免疫缺陷小鼠模型的构建,类,别,序号,名 称,基 因 信 息,特异性免疫,非特异性免疫,免,疫缺,陷小,鼠,1,Nude,Foxn1,nu,无胸腺，无,T,，,B,正常,2,SCID,Prkdc,scid,无,T,，,无,B,正常,3,NOD-SCID,NOD/Prkdc,scid,无,T,，,无,B,NK,补体,4,Rag2,Rag2,-/-,T,、,B,功能缺失,正常,5,IL2RG,Il2rg,-/-,T,、,B,部分功能缺失,NK,6,F344RG,Rag2,-/-,/Il2rg,-/-,T,、,B,功能缺失,NK,功能缺失,7,FPG,Prkdc,-/-,/Il2rg,-/-,T,、,B,功能缺失,NK,功能缺失,8,NOG,NOD/Prkdc,scid,/Il2rg,tm1Sug,无,T,，,无,B,NK,、补体功能缺失,人源化肝脏小鼠模型的构建,工程基因片段,uPA,基因片段,Fah,基因片段,HSVtk/GCV,自杀系统,Tet-on/uPA,自杀系统,其他,移植用人类细胞,肝细胞,造血干细胞,胸腺细胞,其他,（,1,）,uPA-Rag2,小鼠（,Dandri,，,2001,年，德国）,uPA,全称,尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子,（,Urokinase-type Plasminogen Activator,），,当白蛋白启动的,uPA,基因片段在小鼠肝细胞内表达时，纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋白酶，诱发粗面内质网发生裂解损伤，最后肝细胞损伤并逐渐消亡。,Rag2,全称重组激活基因,2,（,Recombination-Activating Gene2,），在,VDJ,基因重排和淋巴细胞发育中起关键性作用。,Rag2,-/-,小鼠为,C57BL/6J,品系背景，,T,、,B,淋巴细胞早期发育严重停滞，外周血没有成熟的循环,T,、,B,淋巴细胞，非特异性免疫收影响小。,Rag2,小鼠,uPA,基因,肝细胞人源化率仅有,15%,，适合病毒学研究，但无法满足代谢研究需求！,（,2,）,uPA-SCID,小鼠（,Tateno,，,2004,年，日本）,SCID,小鼠全名联合缺陷免疫小鼠,（,severe combined immune deficiency,），,其第,16,对染色体隐性基因突变，纯合子的,淋巴细胞抗原受体基因,VDJ,区域的重组酶活性异常，基因重排无法正常进行，影响,B,、,T,细胞的正常分化，外周血白细胞总数减少，但粒细胞、巨噬细胞、,NK,细胞、,LAK,细胞正常。,uPA-SCID,小鼠相比,uPA-Rag2,小鼠具有更高的人源化比率，其肝细胞替换可达,50%,，运用免疫抑制剂后可提升至,70%,，基本满足代谢和毒性研究需求，许多学者利用该模型进行了多种药物研究。,SCID,小鼠,uPA,基因,持续性自发肝损；,出血性疾病导致死亡；,高血补体浓度（,C,3,）肾病；,生殖障碍；,移植窗较小（出生后,2W,内移植）；,存在非特异性免疫，需药物抑制免疫。,名称,基因信息,特异性免疫,非特异性免疫,肝损伤,uPA-SCID,uPA/Prkdc,scid,无,T,无,B,正常,uPA,（,2,）,uPA-SCID,小鼠（,Tateno,，,2004,年，日本）,（,3,）,Fah,小鼠（,Grompe,，,1993,年，波兰）,Fah,全称,延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因,（,fumarylacetoacetatehydrolase,），,Fah,-/-,小鼠酪氨酸代谢受阻，出现,型酪氨酸血症,，毒性产物损伤肝、肾。,2-,硝基,-4-,三氟甲苯,-1,3,环乙烷碘,（,NTBC,）可以抑制酪氨酸降解通路中,4-,对羟基苯丙酮酸双氧化酶（,4-HPPD,）活性，减少毒性代谢产物积聚，起到治疗作用。,NTBC,治疗维持,具有免疫系统，,不适合人源化组织和细胞移植,Fah/nude,Fah/Rag1,Fah/Nod/Scid,ll2rg,基因是白细胞介素,2,受体的,gamma,链（,Il-2R c,，又称,CD132),，是具有免疫功能的细胞因子,Il-2,、,Il-4,、,Il-7,、,Il-9,、,Il-15,和,I-21,的共同受体亚基。,L2rg,-/-,小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是,NK,细胞的活性几乎丧失。,名称,基因信息,特异性免疫,非特异性免疫,肝损伤,FRG,Fah,-/-,/Rag2,-/-,/Il2rg,-/-,T,、,B,功能缺失,NK,Fah,-/-,（,4,）,FRG,小鼠（,Azuma,，,2007,年，波兰）,持续性的自发肝脏；,自发性,型酪氨酸血症,突出,，易诱发肝癌；,需要药物,NTBC,控制肝损伤程度，易对试验结果造成影响；,小鼠存活率不高，饲养时易死亡。,（,4,）,FRG,小鼠（,Azuma,，,2007,年，波兰）,FRG,小鼠在性状和效果上都优于,Fah,-/-,小鼠，其肝细胞替换率达,80%,以上，后经其他学者改进探索，可达,95%,左右。该模型应用于代谢和病毒等多个领域研究，有重要意义。,名称,基因信息,特异性免疫,非特异性免疫,NOG,NOD/Prkdc,scid,/Il2rg,tm1Sug,无,T,，,无,B,NK,、补体功能缺失,（,5,）,NOG,、,NSG,小鼠（,Ito,，,2002,年，日本）,NOG,小鼠由日本实验动物研究所的,Ito,培育而成。通过杂交,NOD/Scid,和,Il2rg,-/-,小鼠而来，其,T,、,B,细胞皆缺失，,NK,细胞功能缺陷。与,NOD/Scid,小鼠相比，,NOG,小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织。,NOG,、,NSG,是类似的并行品系，源于日本为,NOG,（,NOD/Shi-,scid,/Il-2R,c,null,），源于美国为,NSG,（,NOD/,scid,/,C,/,/SzJ,）,。,NOG,小鼠在免疫缺陷模型、肿瘤模型、异种移植模型、传染病模型领域有大量应用。,名称,基因改变,特异性免疫,非特异性免疫,肝损伤,TK-NOG,TK/NOD/Prkdc,scid,/Il2rg,tm1Sug,无,T,，,无,B,NK,、补体功能缺失,HSVtk/GCV,系统,（,6,）,TK-NOG,小鼠（,Hasegawa,，,2011,年，日本）,单纯疱疹病毒胸苷激酶,/,更昔洛韦（,HSVtk/GCV,）系统是分子生物学基因修饰技术中运用十分广泛的自杀系统，,GCV,本身无毒，但是在转染了,HSVtk,基因的细胞中可被磷酸化，成为单磷酸盐，再经内源性细胞激酶作用可转化为二磷酸和三磷酸盐，对细胞有高毒性。,NOG,TK-NOG,具有人肝等效的酶表达及生物功能；,具有较高立体组织结构；,人源化程度高（,90%,）；,生存率高，移植时段宽裕，可重复利用；,无需外源性药物维持性状；,可生殖传代（雌性可与,NOG,小鼠生育）；,在代谢、毒性、病毒、微生物方面大量应用,2011-2017,，美日有诸多研究和数据。,无商业化成品供应，国内来源受限！,（,6,）,TK-NOG,小鼠（,Hasegawa,，,2011,年，日本）,（,7,）,uPA-NOG,小鼠（,Gutti,，,2014,年，美国）,名称,基因改变,特异性免疫,非特异性免疫,肝损伤,uPA-NOG,uPA/NOD/Shi-scid/Il2rg,null,无,T,，,无,B,NK,、补体功能缺失,uPA,uPA-NOG,小鼠是在,NOG,小鼠基础上通过基因修饰加入,uPA,基因培育而来，目前应用相对较少，有报导的文献显示仅应用于病毒学研究，对肝脏人源化指数没有很高要求，仅,10%,左右。,（,8,）,FRGN,小鼠（,Wilson,，,2014,年，美国）,名称,基因改变,特异性免疫,非特异性免疫,肝损伤,FRGN,Fah,/,/NOD/Rag2,/,/Il2rg,/,无,T,，,无,B,NK,、补体功能缺失,Fah,/,FRGN,小鼠是在,NOD,小鼠基础上敲除,Fah,、,Rag2,、,Il2rg,基因培育而来，目前应用相对较少，文献报导肝脏人源化率可达,80%,，并且在免疫重建上也有一定应用趋势。,请多多指正，谢谢！,