分子生物学实验课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,实验目录,实验 一 植物基因组,DNA,提取及纯化,实验 二,PCR,克隆目的基因,实验 三,PCR,产物琼脂糖凝胶电泳,实验 四 目的基因片段与载体连接,实验 五,E.coli,DH5,感受态细胞制备,实验 六 连接产物转化转化大肠杆菌,实验 七 阳性克隆筛选鉴定,实验 八 重组质粒,DNA,提取,实验 九 重组质粒酶切分析与电泳,实验 十 目的片段回收及与表达载体连接,1,.,实验一 植物基因组,DNA,提取,基本原理,1.,基因组,DNA,的提取通常用于构建基因组文库、,Southern,杂交及,PCR,分离基因等。,2.,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组,DNA,的提取方法有所不同,;,不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。,3.,在提取某种特殊组织的,DNA,时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的,DNA,大分子。尤其是组织中的,多糖,和,酚类物质,对随后的酶切、,PCR,反应等,有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组,DNA,时,应考虑,除去多糖和酚类物质。,2,.,4.,核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为,DNA,和,RNA,，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。,在制备核酸时，,通过研磨,破坏细胞壁和细胞膜，使,核蛋白被释放出来。,5.,去除蛋白的方法，通常采用,SDS/CTAB,等,去污剂使蛋白变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取,DNA.,6.,酚,是高效的蛋白质变性剂,，,氯仿,除了进一步去除,蛋白,，也可以去除,残留的酚,。,本实验是通过,SDS,法,提取拟南芥基因组,DNA,。,3,.,SDS,是一种,阴离子去污剂,，,能与细胞膜上的蛋白质结合,，在,65,C,高温下能有效裂解细胞膜，,使基因组,DNA,释放出来,。,在用,SDS-,苯酚法,提取基因组时，酚能够使,SDS-,蛋白质复合物中的,蛋白质变性,，从,而使蛋白质和水溶性的,DNA,分离。,（此法不适用于提取,多糖含量较高,的植物基因组,DNA,提取。）,4,.,1.,掌握植物基因组,DNA,分离、纯化原理,2.,通过,SDS,法提取拟南芥基因组,DNA,。,二 实验目的,5,.,仪器及耗材,：研钵、微量移液器及吸头、,EP,管、台式离心机。,材 料,：拟南芥小苗,试 剂,：,DNA Extract Buffer(0.2M NaCl,25mM EDTA,0.5%SDS,pH 7.5);,70%,乙醇,；酚；氯仿；异丙醇,;RNase,仪器、材料和试剂,6,.,实验步骤,1.,取一定量的拟南芥组织,;,2.,加入,600 l,抽提缓冲液,（,0.2M NaCl,25mM EDTA,0.5%SDS,pH 7.5,），,室温下快速研磨,;,3.,把抽提液从研钵中移至,1.5 ml,离心管中，混匀,;,4.12,000 rpm,离心,10 min(RT),。取上清，,加,等体积的酚,/,氯仿,（,1,：,1,）,混合液,，上下颠倒混匀,；,5.12,000 rpm,5min(RT),，取上清，,加等体积的异丙醇,，,上下颠倒混匀；,6.12,000 rpm,10min(RT),，弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入,1ml,的,70%,乙醇洗沉淀；,7.12,000 rpm,5 min(RT),，,弃上清，倒置于纸巾上待其干燥,；,加,20,l,ddH,2,O,溶解沉淀,;,通过分光光度计或电泳检测,DNA,的浓度和纯度,。,7,.,核酸,DNA,和,RNA,所含碱基的,苯环结构,（,嘌呤环和嘧啶环,）的,共轭双键,具有,紫外吸收的特性,，它们在,260 nm,处有最大的吸收峰,。,因此，可以用,260 nm,波长进行核酸含量测定。,波长为,260 nm,时，,DNA,或,RNA,的光密度的大小,不仅与,总含量有关，,也与它们的,不同构型,有关。,标样：,DNA,浓度为,1 g/mL,时，,OD,260,=0.02,当,OD260=1,时,，,双链,DNA,含量约为,50 g/mL,单链,DNA,含量约为,37 g/mL,RNA,含量约为,40 g/mL,DNA,浓度,(g/L),计算：,50OD,260,读数,RNA,浓度,(g/L),计算：,40OD,260,读数,8,.,9,.,EDTA,的作用,：,抑制内外源,DNase,的活力,。,加螯合剂,(EDTA),除去,酶的辅因子,(Mg,2+,),，使酶的活性丧失。,思考题：在拟南芥基因组提取缓冲液中，,EDTA,和,SDS,的作用分别是什么？,SDS,的作用,：,SDS,能,溶解,细胞膜蛋白,和,核膜蛋白,，使,核蛋白解聚,，从而使,DNA,得以游离出来,。,在适度盐离子存在下，去污剂与蛋白质复合物,溶解度变小,，有助于基因组,DNA,释放。,10,.,实验二,PCR,克隆目的基因,一 实验原理,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应,),：是一种选择性体外扩增,DNA,的方法。它包括三个基本步骤,:,(1),变性,(Denature):,目的双链,DNA,片段在,94,下解链,;,(2),退火,(Anneal):,模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,56,C,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列通过氢键配对,;,(3),延伸,(Extension):,在,TaqDNA,聚合酶合成,DNA,的最适温度下,以目的,DNA,为模板进行合成。,由这,三个基本步骤组成一轮循环，,理论上每一轮循环将使目的,DNA,扩增一倍,这些经合成产生的,DNA,又可作为下一轮循环的模板,所以经,25-35,轮循环就可使,DNA,扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。,11,.,PCR,原理,FLASH,演示,12,.,Taq DNA Polymerase,1988,年,Saiki,等从水生嗜热杆菌,(thermus aquaticus),中提取耐高温的,Taq DNA,多聚酶,(Taq DNA Polymerase),，此酶在,93,下反应,2h,后其残留活性是原来的,60%,。,缺点：,Taq DNA Polymerase,只有,53,聚合酶活性,，,但没有,3 5,外切活性,，,无法消除突变和错配,，,碱基错误掺入率可达,10,-4,/,碱基,/,循环,13,.,Pfu,DNA Polymerase,Pfu,DNA,聚合酶是已知,保真度最高的聚合酶,，来自于,Pyrococcus furiosis,菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有,DNA,聚合酶中掺入出错率最低,的一种。,优点：,Pfu,具有,3 5,校阅功能,，其错配率分别仅为,10,-7,。,缺点：,效率低，扩增片段较短,14,.,Taq Plus DNA Polymerase,是,Taq,和,Pfu DNA,聚合酶的混合物，与,Taq DNA,聚合酶相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增,20kb,复杂模板可有效扩增,10kb),保真度好的特点；与,Pfu DNA,聚合酶相比，具有扩增速度快，反应效率高的优势。,15,.,PCR,反应体系组成,模板,5,引物和,3,引物,4,种,dNTP,DNA,聚合酶,Mg,2+,反应缓冲液,16,.,1.,模板,PCR,反应必须以,DNA,为模板进行扩增,模板,DNA,可以是,单链分子,也可以是,双链分子,可以是,线状分子,也可以是,环状分子,就,模板,DNA,而言,影响,PCR,的主要因素是,数量,和,纯度,纯 度,:,蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制,PCR,反应,完整性,:,模板降解会导致,PCR,扩增无产物,浓 度,:,加量过多导致非特异性扩增增加,17,.,2.,引物,PCR,反应产物的特异性由一对,上下游引物,所决定。引物的好坏往往是,PCR,成败的关键,引物影响因素：,特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体,完整性：避免反复冻融,浓 度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则,扩增产物太少,18,.,引物设计原则,(1),引物长度：,约为,16-30bp,(2)G+C,含量：,G+C,含量通常为,40%-60%,较短引物可粗略估计,Tm,4(G+C)+2(A+T),.,(3),四种碱基,随机分布,，,在,3,端不存在连续,3,个,G,或,C,因这样易导致错误引发。,(4),在引物内及两引物之间,尤其在,3,端应不存在二级结构。,(5),引物,5,端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点。,(6),引物不与模板结合位点以外的序列互补,19,.,4,种,dNTP,浓度适当，避免反复冻融,dNTP,原液配成,10mM,或者,2.5mM,分装,-20,o,C,贮存。,dNTP,应用,NaOH,调,pH,为,7.0,理论上四种,dNTP,各,20mM,一般反应中每种,dNTP,的终浓度为,20-200M,。当,dNTP,终浓度大于,50mM,时可,抑制,Taq DNA,聚合酶的活性,.,4,种,dNTP,的浓度应该相等,以减少合成中由于某种,dNTP,的不足出现的错误掺入。,20,.,Mg,2+,过高非特异性严重，过低无扩增产物,Mg,2+,浓度,对,DNA,聚合酶,影响很大,它可影响,酶的活性,影响,引物退火和解链温度,影响,产物的特异性,以及,引物二聚体的形成,等。,通常,Mg,2+,浓度范围为,0.5-3mM,。,试剂公司通常会将,Mg,2+,加入到,DNA,聚合酶的反应缓冲液中：,10Reaction Buffer(including Mg,2+,),10Reaction Buffer(without Mg,2+,),21,.,DNA,聚合酶,Taq DNA Polymerase,活性半衰期为,95 40min,97 5min.,Taq DNA,聚合酶的酶活性单位定义为,74,下,30min,掺入,10nmol/L dNTP,到核酸中所需的酶量,.,Taq DNA,聚合酶的,一个致命弱点是它的出错率,一般,PCR,中出错率为,210,-4,核苷酸,/,每轮循环,100l PCR,反应中,1.5-2,单位的,Taq DNA,聚合酶就足以进行,30,轮循环,.,反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活,Taq DNA,聚合酶,灭活,Taq DNA,聚合酶的方法有：,(1),PCR,产物经酚,:,氯仿抽提,乙醇沉淀,。,(2),加入,10mmol/L,的,EDTA,螯合,Mg,2+,。,(3),99-100,加热,10min,.,目前已有直接纯化,PCR,产物的,Kit,可用。,Taq/Pfu/Taq Plus DNA Polymerase,22,.,DNA,聚合酶单位定义：,1,个酶单位是指在,74,下，,30min,内，使,10nmol,的,dNTP,掺入到核酸中所需的酶。,不同公司提供的酶,U,的定义也不同。,23,.,反应缓冲液,各种,DNA,聚合酶都有自己特定反应缓冲液；,Taq DNA Polymerase,反应缓冲液一般含：,10-50mM TrisCl(20,下,pH8.3-8.8),50mM KCl,适当浓度的,Mg,2+,24,.,缓冲液,10 mmol/l,Tris.Cl,提供适合反应的,pH,值,（,pH 8.4,）,50 mmol/l,KCl,促进引物退火,10 g/ml,明胶或血清白蛋白，二硫苏糖醇,为,Taq,酶的保护剂，稳定酶的活性,25,.,PCR,反应,主要参数：,1.预变性：,94C,，,3-5min,2.,变性：,94C,，,30s-1min,3.,复性：,56,C,，,20s-2min,4.,延伸：,7,2,C,，,30s-3min,5.,总延伸：72,C,，,10min,26,.,预变性和变性,在第一轮循环前,在,94,下变性,3,5min,非常重要,它可使,模板,DNA,完全解链,。变性不完全,往往使,PCR,失败,因为未变性完全的,DNA,双链会很快复性,减少,DNA,产量,.,一般变性温度与时间为,94 1min,。在变性温度下,双链,DNA,解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。,27,.,退火,引物,退火的温度,和所需,时间的长短,取决于,引物的碱基组成,，,引物的长度,、,引物与模板的配对程度,以及,引物的浓度,.,实际使用的退火温度比扩增引物的,Tm,值约低,5,。,通常退火温度和时间为,55,左右,1-2min,。,28,.,延伸,延伸反应通常为,72,接近于,Taq DNA,聚合酶的最适反应温度,75.,实际上。,延伸反应时间的长短,取决于,目的序列的长度,和,浓度,。,Taq DNA,聚合酶每分钟约可合成,2kb,长的,DNA,。,一般在扩增反应完成后,都需要一步,较长,时间,(10-30min),的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,29,.,循环次数,循环次数主要,取决于,DNA,浓度,。一般而言,25-30,轮,循环已经足够。,循环次数过多,会使,PCR,产物中,非特异性产物,大量增加。,30,.,1.,通过,PCR,从拟南芥基因组中扩增目的基因片段,2.,学习,PCR,仪等仪器的使用,实验目的,31,.,材料：拟南芥基因组,DNA,器材：移液器及吸头，,PCR,管，,PCR,仪，台式离心机。,实验材料和器材,32,.,所需试剂,10PCR 反应缓冲液,dNTP,Mix,:每种,10,m,M,5,和,3,引物：各,10 p,mol/l,（,10,mmol/L,）,Taq DNA 聚合酶,5,U/l,无菌去离子水；,33,.,实验步骤,1.,在,PCR,管中依次混匀下列试剂,(,总体积,50l),5 l 10Buffer(Including MgCl,2,),1l dNTP mix,（各,10,m,M,）,1l,5,上游引物,（,10,M,）,1l,3,下游引物,（,10,M,）,模板,DNA(200 ng),1U Taq DNA,聚合酶,补充,dd H,2,O,至,50l,混匀后短暂离心（点离）。,34,.,2.,将,PCR,管放置到,PCR,仪中，盖好盖子,3.,用,94,o,C,预变性,3-5,分钟；,94,o,C,变性,1,分钟，,58,o,C,退火,1,分钟,72,o,C,延伸,2,分钟,32,个循环；最后一轮循环结束后,于,72,o,C,下保温,10,分钟，,4.,终止反应，从,PCR,仪取出,PCR,管，放置,4,o,C,存,35,.,1,.PCR,非常灵敏,尽可能,避免污染,。吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂；,2.,加试剂前,应短促离心,10,秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面；,3.,应设含除模板,DNA,所有其它成分的负对照。,注意事项,36,.,思考题简述,PCR,克隆的主要原理,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应,),：是一种选择性体外扩增,DNA,的方法。它包括三个基本步骤,:,(1),变性,(Denature):,目的双链,DNA,片段在,94,下解链,;,(2),退火,(Anneal):,模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,56,C,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列通过氢键配对,;,(3),延伸,(Extension):,在,TaqDNA,聚合酶合成,DNA,的最适温度下,以目的,DNA,为模板进行合成。,37,.,配置常规,PCR,反应体系，对其组成及其各个组分应该注意哪些事项？,（,1,）模板,（,2,）引物,（,3,）,4,种,dNTP,浓度适当，避免反复冻融,（,4,）,Mg,2+,过高非特异性严重，过低无扩增产物,纯 度,:,蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制,PCR,反应,完整性,:,模板降解会导致,PCR,扩增无产物,浓 度,:,加量过多导致非特异性扩增增加,特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体,完整性：避免反复冻融,浓 度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则,扩增产物太少,38,.,实验三,PCR,产物琼脂糖凝胶电泳,39,.,一、实验原理,琼脂糖是一种,天然聚合长链状分子,，,琼脂糖是从琼脂中分离得到，由,1,3,连接的吡喃型,b-D-,半乳糖和,1,4,连接的,3,6,脱水吡喃型阿,a-L-,半乳糖组成，形成相对分子量为,104,105,的长链,。,琼脂糖,加热溶解后,分子呈,随机线团状,分布，当,温度降低,时,链间糖分子上的羟基,通过,氢键作用,相连接，形成,刚性孔径结构,，而,随着,琼脂糖浓度,不同,形成,不同大小的孔径,。,40,.,DNA,分子在,碱性缓冲液,中带,负电荷,，在外加电场作用下向,正极泳动,。,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有,电荷效应,与,分子筛效应,。,不同,DNA,的,分子量大小及构型,不同，电泳时的,泳动率,就不同，从而分出不同的,区带,。,41,.,影响,DNA,迁移速率因素,DNA,分子泳动主要的因素分两方面：,DNA,分子特性,和,电泳条件,。,1.,DNA,的分子大小,:,双链,DNA,分子迁移的速率,与,DNA,分子量对数,成,反比,。,分子量越大，迁移率越小,；,2.DNA,分子的构象,：,超螺旋,（最快）,开环 线状,（最慢）,；,3.,琼脂糖浓度,：,浓度越低,，相同核酸分子,迁移越快,，一般常用的,凝胶浓度,为,1%,2%,；,4.,电场强度,：,电场强度越大,DNA,分子,泳动速率越快,，但是,凝胶的,有效分离范围,随着,电场强度的增大,而,减小,，所以电泳时一般采用低压,(,一般,5V/cm,);,5.,嵌入染料的存在：,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线装和带缺口的环状,DNA,，使其刚性更强，还会使线状,DNA,的电泳迁移率降低,15%,6.,离子强度影响,(,电泳缓冲液,),：,常见的有，,TAE,、,TBE,、,TPE,42,.,核酸电泳缓冲液,有三种,Tris-,乙酸,(TAE),、,Tris-,硼酸,(TBE),和,Tris-,磷酸,(TPE),.,43,.,DNA,电泳上样缓冲液,DNA Loading Buffer,作用,1.,螯合,Mg,2,，防止电泳过程中,DNA,被降解,，一般上样缓冲液中含,10 mM EDTA,。,2.,增加样品密度以保证,DNA,沉入加样孔,，一般上样缓冲液中加入一定浓度的,甘油,或,蔗糖,，这样可以增加,样品的比重,。,3.,指示剂监测电泳的行进过程,，一般加入泳动速率较快的,溴酚蓝,指示,电泳的前沿,，,它的速率约与,300 bp,的线状双链,DNA,相同,。,44,.,DNA,电泳的标准分子量,目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于,PCR,产物鉴定的小分子,Marker,，也有常规用的大分子,Marker,。,常用的,DNA,标准分子量电泳图,45,.,二、实验目的,1,掌握琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,的原理和方法,2,通过琼脂糖凝胶电泳检测,PCR,扩增的目的基因,46,.,仪器及耗材,：天平、电泳设备、台式离心机、称量纸、药勺、微量移液器及吸头、,EP,管、封口膜、三角瓶、微波炉、凝胶成像系统。,材 料,：,PCR,产物,试 剂,：琼脂糖，,1TAE,电泳缓冲液,、,SuprtRed,、,6Loading buffer,、无菌去离子水、,DNA Marker,；,三、实验仪器、材料和试剂,47,.,四、实验步骤,1.,称取,1 g,琼脂糖加入,100 mL 0.5TAE,电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中（或电炉上）加热至琼脂糖完全溶解；,2.,将制胶板放好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约,50,）倒入，室温冷却凝固；,3.,充分凝固后将胶板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入电泳槽中，加,0.5TAE,电泳缓冲液至液面覆盖凝胶,1-2 mm,。,48,.,4.,用移液器吸取,3L 6loading buffer,于一新,PCR,管中，再加入,5 L PCR,产物，混匀后，小心加入点样孔。（,尤其要注意不能破坏点样孔！,）,由于,2,Taq Mix,中已含有,loading buffer,，故可以直接将,PCR,产物加入点样孔中。,用移液器吸取,适量的,DNA Marker,加入,第一个或者最后一个,点样孔中。,打开电源开关，,一般,红色为正极,黑色为负极,，,调节电压至,3-5V/cm,，可见到,溴酚蓝条,带由,负极向正极,移动，电泳约,30 min-60 min,。,7.,电泳结束后,将凝胶置于凝胶成像仪内，再紫外灯下检测,PCR,产物的,DNA,条带。,49,.,注意事项,1.,倒凝胶时,，琼脂糖凝胶温度,不能太高或太低,；,2.,点样时，枪头要,探入点样孔,，,不要戳穿凝胶,；,50,.,实验四 目的基因与载体连接,51,.,一、实验原理,目的基因与载体连接,平末端连接,粘性末端连接,T,载体策略连接,52,.,平末端连接,Taq DNA,聚合酶往往,在,PCR,产物,3,端加上多余的非模板依赖碱基,，在用平末端连接克隆,PCR,产物前，可用,Klenow,片段或,T4 DNA,聚合酶处理补平末端。,有些,DNA,聚合酶（,pfu DNA,聚合酶,）扩增的,PCR,产物为,平端,，可以,直接用于平端连接,53,.,粘性末端连接,利用引物中,附加在,5,端的限制酶位点，,直接将,PCR,产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接，产生重组,DNA,。,如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点经酶切后定向克隆到载体中。,54,.,T-,载体连接,（,TA,克隆）,TaqDNA,聚合酶能在平端双链,DNA,的,3,末端加一个,非模板依赖碱基,(A,或,T),，所加碱基,多为,A,。,利用这一特点，,可以经限制酶,(,如,EcoRV),切割载体，使其产生平末端，,再利用,Taq DNA,聚合酶向载体双链,DNA,的,3,末端加上,T,，使载体与,PCR,产物末端互补并进行连接。,55,.,pMD18-T Vector,pMD18-T Vector,是一种,高效克隆,PCR,产物,（,TA Cloning,）的,专用载体,。用,EcoR V,进行酶切反应后，再在两侧的,3,端添加“,T”,而成。，本制品中的高效连接液,Solution I,可以在短时间内（约,30,分钟）完成连接反应，大大方便了实验操作。,56,.,DNA,连接酶的特性,DNA,连接酶主要有两种：,大肠杆菌,DNA,连接酶,和,大肠杆菌,T,4,噬菌体,DNA,连接酶,。,大肠杆菌DNA连接酶,：,需要,NAD,+,作为辅助因子参与催化，,一般指催化,粘性末端,的连接，,在,PEG,下,也能进行,平端,的连接。,T,4,噬菌体DNA连接酶,：,需要,ATP,作为辅助因子参与催化。,不需要,PEG,也能进行,平端的连接,，,绝大多数情况下使用,T,4,噬菌体DNA连接酶,57,.,DNA,连接的影响因素,温度与时间,理论上,连接反应的,最佳温度是,37,C,，此时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定，因此找了另一个最适温度即,1216,C,酶量 在实际反应中，酶量是过量的,缓冲体系 不同公司的连接酶缓冲液大部分含有,Tris-HCL(pH7.5),，提供连接反应所需的合适,pH,。另外在缓冲液中还有,DTT(,二硫苏糖醇,),和,ATP,，也非常重要。,DTT,提供一定的还原力,，而,ATP,能促进连接反应的有效进行。,（缓冲液使用时的,反复冻融,会,引起,ATP,的分解,）,DNA,浓度 为了降低载体分子间的环化，载体,DNA,的浓度不宜过高,58,.,克隆载体,是相对于表达载体而言的，,是指可携带插入的外源,DNA,片段并可转入受体细胞中大量扩增的,DNA,分子。,该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记。常见的载体有：,质粒,、,噬菌体,、,酵母人工染色体,。,对克隆载体有以下几点要求：,1,）能在宿主细胞中复制繁殖。,2,）容易进入宿主细胞，,3,）容易插入外来核苷酸片段，插入后不影响其复制功能。,4,）容易从宿主细胞中分离出来。,5,）有容易被筛选识别的标志。,59,.,二、实验目的,通过,T,载体策略进行目的基因与载体的连接,60,.,仪器及耗材,：台式离心机、微量移液器及吸头、,EP,管、封口膜、水浴锅。,材 料,：,PCR,产物,试 剂,：,无水乙醇，,70%,乙醇、,3M NaAc,（,pH5.2,）、无菌去离子水；,pMD18-T,三、实验仪器、材料和试剂,61,.,四、实验步骤,1.,将,PCR,产物中加入,等体积的酚,/,氯仿（,1,：,1,）混合液,，上下颠倒混匀，,12,000 rpm,4,，离心,5 min;,2.,取上清，加入,1/10,倍体积的,3 M NaAc,和,2.5,倍体积的无水乙醇,，混匀，,20,放置,10 min;,3.12,000 rpm,4,，离心,5 min,；,4.,弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入,500 L 70%,乙醇洗沉淀，,12,000 rpm,4,，离心,5 min,；,5.,去上清，倒置吸水纸上，晾干，加入,20 L,去离子水溶,DNA,沉淀。,62,.,6.,测定,DNA,的浓度；,7.,沉淀的目的基因,DNA,与载体连接：,取一新的,PCR,管，加入下列反应成分,(,总体积,10l),：,目的,DNA 4.5,l,(0.1 pmol,0.3 pmol),pMD18-T Vector 0.5 l,加入,5 l,（等量）的,Solution I,；,8.16,C,水浴中反应,30分钟。,63,.,实验五 大肠杆菌感受态细胞制备,64,.,一 实验原理,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内。,人工构建的质粒载体不能凭自己的能力进入细菌,。,如需将质粒载体转移进受体细菌，,需诱导受体细菌产生一种,短暂的感受态,以,摄取外源,DNA,。,细菌处于容易吸收外源,DNA,的状态,叫,感受态,。,65,.,感受态细胞制备方法,化学法,:,CaCl,2,处理后细胞膜的通透性发生了,暂时性的改变,成为,能允许外源,DNA,分子,进入的,感受态细胞,；,物理法,:,大肠杆菌,暴露在电荷中,时，其,细胞膜会不稳定而诱导形成孔洞,，于是,DNA,分子可由该孔进入细胞,。,66,.,感受态细胞制备中应注意因素,细胞生长状态和密度,不要用经过多次转接或储于的培养菌，,最好从,70,或,-20,甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液,。,细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的,OD,600,来控制。,DH5,菌株的,OD,600,为,0.5,时,细胞密度在,510,7,个,/ml,左右,(,不同的菌株情况有所不同,),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,试剂的质量,所用的试剂,如,CaCl,2,等均需较高纯度,，冰箱保存。,3.,防止杂菌和杂,DNA,的污染,整个操作过程均应在,无菌条件,下进行,所用器皿,如离心管,tip,头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、,DNA,酶或杂,DNA,所污染。,67,.,二 实验目的,1.,学习,以,E.coli,DH5,菌株为受体细胞，用,CaCl,2,处理受体菌使其处于为感受态；,2.,制备大肠杆菌感受态细胞，为转化实验作准备。,68,.,仪器及耗材,：培养皿、细菌投布器、三角瓶、牙签、恒温摇床、电热恒温培养箱、分光光度计、冷冻离心机、,50mL,离心管、无菌工作台,材 料,：,E.coli,DH5,菌株,试 剂,：,LB,固体和液体培养基、,100 mM CaCl,2,、,甘油,（,保护细菌的细胞膜,）。,三、实验仪器、材料和试剂,69,.,LB,液体培养基,(Luria-Bertani),配方：,蛋白胨,(Tryptone)1 g,酵母提取物,(Yeast extract)0.5 g,NaCl 1 g,加去离子水至总体积,100 mL,，用,NaOH,调,pH,至,7.0,高压灭菌,LB,固体培养基配方：,每,100mL LB,液体培养基中加,1.2g,琼脂粉,高压灭菌。,70,.,四,实验步骤,菌株活化,1,用接种环直接取冻存的大肠杆菌,DH5,，在,LB,培养基平板表面划线，于,37,培养,16,小时；,2,挑取一个单菌落，转到,10 ml LB,培养基中，于,37,培养,3,5,小时；,3,将培养液全部转到,100mlLB,培养基中培养,2,3,小时，到,OD,600,0.45-0.55,71,.,感受态细胞制备,4.,将,30ml,菌液转入离心管中，冰上,10 min;,4,o,C,，,5,000 rpm,，离心,5 min,；,6.,去上清，将沉淀重悬于,10 ml,用冰预冷的,100,mM,CaCl,2,中，置于冰上,30 min,；,7.4,o,C,，,5,000 rpm,，离心,5 min,；,8.,去上清，将沉淀重悬于,1,mL,用冰预冷,的,100,mM,CaCl,2,溶液中，,再加入,70%,甘油,至终浓度为,15-20%(0.4ml),混匀；,9.,按每管,100,l,分装，冰上放置几分钟,即成感受态细胞，,-70,o,C,冰箱中保存,.,72,.,实验六 连接产物转化大肠杆菌,73,.,一 实验原理,转化是,将外源,DNA,分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。,（考点）,74,.,（,1,）热激法转化,大肠杆菌感受态细胞与重组质粒,DNA,放置在冰浴,(0,o,C),，,CaCl,2,低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形,。,转化混合物中的,DNA,形成,抗,DNA,酶,的,羟基,钙磷酸复合物,粘附于细胞表面。,经突然热激（,42,o,C,）处理，更有利于细胞对,DNA,复合物的摄取。,外源,DNA,分子通过,吸附、转入、自稳,而进入细胞内，并且开始进行复制和表达。,(,考点,),75,.,将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型,(,如,Amp,r,等,),得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有,氨苄青霉素,的选择性培养基上,。,（考点）,76,.,（,2,）电击法转化,电击法制备的大肠杆菌感受态细胞用于,电击转化,。当感受态细胞受到瞬时的高压脉冲，细胞膜形成小凹陷，并形成数纳米的疏水性孔洞，后部分转变为,亲水型孔洞,。,在孔洞开放的时候，,DNA,就很容易通过孔洞进入细胞，实现大肠杆菌的转化。,77,.,分子转化分以下几步,:,吸附,-,双链分子吸附于受体菌表面,；,转入,-,双链分子解链。一条链进入受体菌，另 一条降解；,自稳,-,外源质粒分子在细胞内复制成双链,；,表达,-,供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。,（考点）,78,.,二 实验目的,将目的基因与质粒的连接产物转入大肠杆菌（,DH5,）感受态细胞，为,重组载体的筛选最准备,79,.,仪器及耗材,：培养皿、细菌投布器、三角瓶、恒温摇床、电热恒温培养箱、水浴锅、无菌工作台,材 料,：目的基因与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞,试 剂,：,LB,固体和液体培养基、,氨苄青霉素,(100 mg/mL),、,IPTG(200 mg/mL),、,X-gal(20mg/mL),。,三、实验仪器、材料和试剂,80,.,氨苄青霉素,(Amp),配置：,无菌水配制,氨苄青霉素,成,100 mg/mL,溶液，过滤除菌，,-20,o,C,冰箱保存；,X-gal,配置：,将,X-gal,溶于二甲基甲酰胺中，配成,20 mg/mL,浓度的溶液，装于玻璃或聚丙烯管中，以锡铂纸包裹避光保存于,-20,o,C,，,X-gal,不需要过滤除菌；,IPTG,配置：,将,2 g IPTG,溶于,8 mL,水中，用水调节体积到,10 mL,过滤除菌，,-20,o,C,冰箱保存。,81,.,固体,LB,平板的准备,1.,固体,LB,培养基的配置：每,100 mL,液体,LB,培养基加入,1.2 g,琼脂粉，,pH 7.0,，高温灭菌；,2.,固体,LB,培养基融化后，冷却到,50,o,C,，加入氨苄青霉素（,100g/mL,），再倒入灭菌的平板内；,3.,在,LB,固体培养基表面均匀投布,4L IPTG(200 mg/mL),和,40L x-gal(20mg/mL),吹干,;,四 实验步骤,82,.,4.,从,-70,o,C,冰箱中取出感受态细胞,置冰上解冻；,5.,在超净台上，取,5,l,连接产物加入到感受态细胞中，充分混匀，冰上,放,置,30 min,；,6.,42,o,C,热激处理,90 sec,，热击后迅速置于冰上冷却,3-5,分钟；,7.,加入,600,800,l,无抗生素的,LB,液体培养基，,37,o,C,，,50,60 rpm,温育,45 min,，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因；,8.,菌液均匀涂布到,含有抗生素,（,Amp 100,g/ml,并均匀的涂布有,IPTG,和,X-gal,）的,LB,平板上吹干，将培养皿倒置于,37,o,C,，培养,16 h,；,83,.,影响转化效率的因素有哪些？,细菌生长的状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。,所有操作均应该在无菌条件和冰上进行。,经过,CaCl,2,处理的细胞，在低温条件下，一定时间内的转化率随时间的推移而增加，,24,小时达到最高，之后转化率下降。,化合物及无机离子的影响,所用器皿必须干净，微量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。,质粒的大小及构型的影响：用于转化的主要是超螺旋的,DNA,。,一定范围内，转化效率与外源,DNA,的浓度成正比。,84,.,实验七 阳性克隆的筛选鉴定,85,.,将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后，在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体的自连和目的基因的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的,DNA,片断。,这就需要我们对,阳性克隆进行鉴定和筛选,，,将,含有外源,DNA,的宿主细胞,和,不含外源,DNA,的宿主细胞,分开,，将含,有正确重组子的宿主细胞,和,含有其他外源,DNA,的宿主细胞,分开。,一 实验原理,86,.,在实验中，目的基因与,T,载体,(pMD18-T),连接产物,转化,E.coli,DH5,菌株。由于,pMD18-T,上带有,Amp,r,和,lacZ,基因,故重组子的筛选首先采用,Amp,抗性筛选与,-,互补现象筛选相结合的方法。,87,.,因,pMD18,带有,Amp,r,基因而外源片段上不带该基因,故转化,受体菌后只有带有,pMD18,的转化子,才能在含有,Amp,的,LB,平板上存活下来,（质粒自身环化和重组载体）；,而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。,此为初步的抗性筛选。,88,.,-,互补,pMD18-T,上带有,-,半乳糖苷酶基因,(,lacZ,),的调控序列和,-,半乳糖苷酶,N,端,146,个氨基酸的编码序列。,这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏,lacZ,的阅读框架,不影响其正常功能。,DH5,菌株带有,-,半乳糖苷酶,C,端部分序列编码信息。,在各自独立的情况下,pMD18,-T,和,DH5,编码的,-,半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。当这种载体转入可编码,半乳糖苷酶,C,端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基,-D,硫代半乳糖苷（,IPTG,）的诱导下，,宿主可同时合成这两种肽段，,虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为,-,互补现象。,89,.,由互补产生的,半乳糖苷酶,(,Lac,Z),能够作用于生色底物,5,溴,4,氯,