微生物常规鉴定技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章,微生物常规鉴定技术,微生物形态结构和培养特性观察,微生物生理生化检验,微生物血清学检验,沙门菌检验（应用）,培养特性：指微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。,形态结构：通过染色，在显微镜下微生物的形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性。,一、,培养特性和形态结构观察,细菌的培养特性,固体培养基,菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性,液体培养基,表面生长情况（菌膜、环）、混浊度及沉淀,半固体培养基,穿刺接种观察运动、扩散情况,（一）,培养特性,1,.,点状,2.,圆形,3.,丝状,4.,不规则形,5.,假根状,6.,纺锤状,7.,扁平,8.,隆起,9.,凸起,10.,垫状,11.,脐状,12.,边缘整齐,13.,波状,14.,裂片状,15.,啮蚀状,16.,丝状,17.,卷发状,18.,丝线状,19.,刺毛状,20.,串珠状,21.,疏展状,22.,树根状,23.,假根状,细菌的培养特征,24.,丝状,25.,串珠状,26.,乳头状,27.,绒毛状,28.,树根状,29.,量杯状,30.,萝卜状,31.,漏斗状,32.,囊状,33.,层状,34.,絮状,35.,环状,36.,蹼状,37.,膜状,金葡在不同平板上的菌落特征,大肠杆菌在不同培养基上的菌落特征,沙门氏菌在不同平板上的菌落特征,李斯特氏菌在不同平板上的菌落特征,固体斜面培养,液体培养基,半固体培养,酵母的培养特性,固体培养基,菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征,液体培养基,表面生长情况（菌膜、环）、混浊度及沉淀,（一）,培养特性,酵母的菌落特征,霉菌的培养特性,固体培养基,菌落大小、颜色（正反面）、菌落表面形状、,菌落组织形状,液体培养基,表面生长情况（菌膜、环）、混浊度及沉淀,（一）,培养特性,棉絮状毛霉菌落特征,地毯状青霉菌落特征,蜘蛛网状根霉菌落特征,绒毛状曲霉菌落特征,放线菌的培养特性,固体培养基,菌落大小、颜色（正反面）、光泽度、质地、菌落表面形状、菌落组织形状,液体培养基,静置培养：表面生长情况（菌膜、环）、沉淀,振荡培养：球状菌丝团,（一）,培养特性,产抗菌素的放线菌的菌落特征,A,：卡特利链霉菌；,B,：弗氏链霉菌；,C,：吸水链霉菌金泪亚种；,D,：卡那霉素链霉菌；,E,：除虫链霉菌；,F,：生磺酸链霉菌,A,：诺尔斯氏链霉菌；,B,：皮疽诺卡氏菌,（二）,形态结构,细菌的形态结构,细菌的基本形态,细菌大小,细菌细胞结构（染色观察）,细菌的基本形态,单球菌,如尿素小球菌,双球菌,如肺炎双球菌,四联球菌,如四联小球菌,球菌形态,八叠球菌,如尿素八叠球菌,链球菌,如乳链球菌,葡萄球菌,如金黄色葡萄球菌,球菌形态,短杆菌,长杆菌,梭状芽孢杆菌,杆菌形态,单杆菌,链状杆菌,杆菌细胞两端的形态特征,弧菌,螺旋菌,螺旋体,螺旋菌形态,特殊形态,异 常 形 态,细 菌 大 小,细菌大小的测定：,(1),测量：测微尺,(2),长度单位：微米,(m),(3),表示：,球菌：直径,杆菌：宽,长,螺菌：宽、长、螺距,细菌的大小,细 菌 细胞结构,阴性菌,阳性菌,革兰氏染色法,芽孢染色法,细菌芽孢的各种类型,芽孢的在细胞,中的位置,鞭毛染色法,鞭毛的着生方式,荚膜染色法,（二）,形态结构,酵母的形态结构,酵母的基本形态,酵母大小,酵母细胞结构（染色观察）,（二）,形态结构,放线菌的形态结构,放线菌的基本结构,链霉菌孢子丝形态,分生孢子的形成过程,（二）,形态结构,二、微生物,生理生化检验,碳水化合物代谢试验,蛋白质类代谢试验,有机盐类试验,酶类试验,其他生化试验,（一）,碳水化合物代谢试验,糖（醇、苷）类发酵试验,葡萄糖氧化发酵试验（,O/F,试验）,-,半乳糖苷酶试验（,ONPG,试验）,七叶苷水解试验,甲基红试验,V-P,试验,糖（醇、苷）类发酵试验方法,原理：,多糖单糖丙酮酸酸性产物,(,或产酸产气,),pH,指示剂呈酸性变色（若产气者有气泡出现）,培养基,指示剂,酚红（p,H,：,6.88.4,）,色泽变化（酸,碱：黄,红）,方法,将纯种细菌以无菌操作接种到含有指示剂的培养基中，置,35,温箱培养数小时至两周，观察结果。,伤寒沙门菌,甲型副伤寒,糖（醇、苷）类发酵试验结果,应用：,主要用于肠杆菌科的鉴定。,原理：,细菌分解葡萄糖对,O,2,需求不同，,氧化型：细菌只在有氧环境中分解葡萄糖；,发酵型：细菌可在有氧、无氧环境中分解,G;,产碱型：细菌在有氧、无氧环境中都不,分解葡萄糖,;,葡萄糖氧化,/,发酵试验,方法：,取,2,支,HL,葡萄糖培养管煮沸，待冷后接种菌种。一管管口敞开，一管用液体石蜡封管，培养,18,24,h,观察结果。,葡萄糖氧化,/,发酵试验方法,大肠杆菌 铜绿假单胞菌 粪产碱杆菌,葡萄糖氧化,/,发酵试验结果,两管均分解葡萄糖,大肠杆菌,发酵型,开管分解葡萄糖,封闭管不分解葡萄糖,氧化型,铜绿假单胞菌,开管、封管均不分解葡萄糖,粪产杆菌,产碱型,应用：,主要用于革兰阴性杆菌的鉴别。,葡萄糖氧化,/,发酵试验,原理：,有,-,半乳糖苷酶的细菌，可以分解邻硝基酚,-,半乳糖苷,(,ONPG,),而释放黄色的邻硝基酚。,应用：,常用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定。,-,半乳糖苷酶试验（,ONPG,）,-,半乳糖苷酶试验（,ONPG,）方法,方法：,取新鲜细菌一环，加人到,0.25,ml,的无菌生理盐水中，加甲苯一滴充分振动，,37,、,5,min,，再加入无色,ONPG,溶液,0.25,ml,，置,37,水浴，悬液变黄则为阳性。,。,-,半乳糖苷酶试验（,ONPG,）结果,阴性 阳性,原理：,七叶苷可以被细菌分解为葡萄糖和七叶,素，七叶素与培养基中的,Fe,2+,反应，形成黑,色化合物，使培养基变黑。,七叶苷水解试验,应用：,主要用于,D,群链球菌与其他链球菌的鉴别。,方法,：,将待检菌接种于七叶苷培养基上，培养后观察结果。,七叶苷水解试验方法,甲基红试验,原理：,细菌分解培养基中的葡萄糖丙酮,酸大量混合酸培养基,pH4.4,以下,甲基红试剂培养基变红。,应用：,主要用于大肠和产气肠杆菌鉴定。,方法：,将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中,35,培养,6,18,小时后,往培养基中加入甲基红指示剂少许,观察结果。,甲基红试验,空白对照 阴性 阳性,原理：,某些细菌分解糖类丙酮酸继续脱羧,乙酰甲基甲醇（碱性）空气氧化双乙酰,+-,萘酚、肌酸红色化合物。,V-P,试验,应用：,主要用于鉴别大肠和产气肠杆菌。,V-P,试验,方法：,将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，,35,培养,48,h,后按每毫升培养基加入,0.1,ml,含,2,肌酸或肌酐的,40,KOH,溶液,数分钟或数小时后观察结果。,空白对照 阴性 阳性,（二）,蛋白质类代谢试验,靛基质试验,硫化氢试验,苯丙氨酸脱氨酶试验,尿素酶试验,原理：,含有色氨酸酶的细菌，能分解色氨酸产生吲哚，,吲哚能与对二甲氨基苯甲醛作用，形成红色玫瑰吲哚。,吲哚（靛基质）试验,应用：,主要用于肠杆菌科中产气肠杆菌与大肠埃希菌的鉴别，常与,MR,试验联用。,吲哚（靛基质）试验,方法：,将待检菌接种于胰蛋白胨水中，,35,培养,24,48,h,，取出后沿试管壁缓慢加入靛基质试剂数滴，在两液面观察结果。,硫化氢试验,原理：,有些细菌能分解含硫氨基酸，产生,H2S,与培养,基中的铅盐或铁盐发生反应，,生成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀。,应用：,肠杆菌科的属间鉴定,方法：,将细菌穿刺接种到醋酸铅培养基中，,35,、,24,48h,，,观察结果。,硫化氢试验,苯丙氨酸脱氨酶试验,原理：,有苯丙氨酸脱氨酶的细菌，可以使苯丙氨酸脱氨,形成苯丙酮酸，苯丙铜酸与三氯化铁作用形成绿色化合物。,应用：,多用于肠杆菌科的鉴定。,苯丙氨酸脱氨酶试验,方法：,琼脂斜面法：将待检细菌接种到苯丙氨酸琼脂斜面上，,35,培养,24,48,h,，取出，将三氯化铁试剂,4,5,滴滴于斜面上，观察结果。,快速纸片法：将待检菌涂于苯丙氨酸纸片上，孵育,15,min,，取出，滴加三氯化铁试剂，立即观察结果。,绿色阳性,黄色阴性,原理：,产生尿素酶的细菌,能分解尿素产生氨和,CO,2,氨在溶液中形成碳酸铵，使培养基变碱，酚红指示剂变红。,尿素分解试验,应用：,肠杆菌科属间鉴别。,方法：,将待检菌接种于尿素培养基中，,35,培养,18,24h,取出观察。,对照,阳性,阴性,尿素分解试验,枸橼酸盐利用试验,硝酸盐还原试验,（三）,有机盐类试验,枸橼酸盐利用试验,原理：,能利用枸橼酸盐的细菌，也能利用铵盐,作为唯一的碳源，分解后生成碳酸钠和氨，,使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝,由浅绿色变为深蓝色。,应用：,主要用于肠杆菌科属间的鉴别。,枸橼酸盐利用试验,方法：,将待检菌接种于含有枸橼酸盐和铵盐,的西蒙和柯氏培养基培养,18,24h,后，观,察结果。,蓝色为阳性,绿色为阴性,原理：,使硝酸盐还原的细菌能从硝酸盐中获得氧，使其,成为亚硝酸盐或其它还原物。培养基中的亚硝酸基能,与,-,萘氨和苯磺酸形成红色的,N-,萘氨偶氮苯磺酸。,若出现红色现象则说明该菌还原硝酸盐。,硝酸盐还原试验,应用：,有助于鉴别肠杆菌科、嗜血杆菌属、奈,瑟菌属、布兰汉菌属、假单胞菌属等,方法：,取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜面上，,35,培养,1824,小时，然后依次加入含,-,萘氨和对氨基苯磺酸的试剂各,1mL,，,30s,后观察结果。,硝酸盐还原试验,红色为阳性,无色为阴性,（四）,酶类试验,细胞色素氧化酶试验,过氧化氢酶试验,凝固酶试验,原理：,某些细菌具有细胞色素氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化成紫红色,醌类化合物。,氧化酶试验,应用：,用于科别鉴定试验,方法：,滤纸法：用洁净滤纸蘸取菌落，加一滴试剂，观察结果,菌落法：直接在菌落上加试剂，观察结果,纸片法：使用试剂浸泡制成的试剂纸片，取足够的菌落，观察结果。,氧化酶试验,滤纸法：阳性结果,纸片法：阳性、阴性结果,氧化酶试验,原理：,有触,酶,的细菌能催化过氧化氢生成水和,初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。,触酶试验,应用：,用于革兰阳性球菌初步分属。,触酶试验,方法：,用接种环取备检菌少许，置于洁净的玻片上，滴加,3%,的过氧化氢,1,2,滴，观察结果。,试管法：用洁净的玻棒蘸取待检菌少许，置于装有,3%,过氧化氢的试管内，观察结果。,血浆凝固酶试验,原理：,有些细菌能产生血浆凝固酶，可以使人,和动物血浆中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白,，从而使血浆凝固。,应用：,主要用于金葡菌的鉴定。,血浆凝固酶试验,方法：,玻片法：取洁净玻片一张，加生理盐水两小滴于玻片两端，用接种环挑取待检菌落和对照菌均匀涂于盐水中，制成浓菌液，加兔或人血浆一滴于菌液中，观察结果。,试管法：于,3,支试管中分别加入,1:4,稀释的血浆,0.5,ml,，,1,支管加入待检菌肉汤培养物,0.5,ml,另两支分别加阴阳性对照菌肉汤培养物,0.5,ml,，,35,培养,3,4,h,后观察结果。,血浆凝固酶试验,（五）,其他试验,胆汁溶菌试验,CAMP,试验,氢氧化钾拉丝试验,原理：,胆盐、取氧胆酸钠和硫磺胆酸钠能选择性地,溶解肺炎链球菌，其它链球菌则能耐受这些试剂。,胆汁溶菌试验,应用：,主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌。,方法：,平板法：取胆酸钠溶液一环，放在平板的菌落上，,3530,min,观察结果。,试管法：于,0.9,ml,培养了,18,24,小时的菌液中，加入取氧胆酸钠试剂,0.1,ml,或牛胆盐,0.2,ml,混匀，,37,水浴,10,30,min,，观察结果。,。,胆汁溶菌试验,CAMP,试验,原理：,B,群链球菌能产生一种胞外因子,CAMP,它能增强金黄色葡萄球菌,-,溶血毒素的活性，因此，在两菌交界处出现箭头样的溶血增强区。,应用：,用于鉴定,B,群链球菌。,方法：,取血平板一块，用产生,-,溶血毒素的金葡菌在中央划一道线，将待检菌据此线,0.5cm,处垂直划线。,351824,小时培养，观察结果。,CAMP,试验,三、微生物,血清学检验,血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。,经典的免疫学反应,凝集反应,沉淀反应,补体结合反应,中和反应,凝集反应,颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（,Agglutination reaction,）。,直接凝集反应,玻片凝集法：痢疾杆菌的检测,试管凝集法：伤寒、付伤寒杆菌的检测,间接凝集反应,沉淀反应,可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（,Precipitation,）。,液相沉淀反应,絮状试验,环状试验,凝胶内沉淀反应,扩散试验,免疫电泳技术,液相内沉淀反应,絮状沉淀反应,环状沉淀反应,+,+,抗血清,抗原,抗原,抗体,凝集内沉淀反应,免疫扩散技术,免疫电泳技术,单向扩散试验,双向扩散试验,火箭电泳,对流电泳,免疫电泳,补体结合反应,补体结合反应,(Complement fixation reaction),是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。,待检系统,指示系统,补体,待检系统,指示系统（不溶血）,补体消耗,中和反应,细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应,美国细菌学家,Salmon,与,Smith,于1885年分离出猪霍乱沙门菌。1990年为纪念,Salmon，,定名这类细菌为沙门菌属。,沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌。包括伤寒、副伤寒甲、乙、丙型，肠炎，鼠伤寒等沙门菌，现今已发现2,324,个血清型。,四、,沙门菌检测,（一）,沙门菌特性,生物学特性,形态,两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，（0.4-0.9）,m,(1-3),m，,无芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少数有包膜。,光滑型的细菌大小均匀，粗糙型则大小不一，长短不一。,培养特性,在营养琼脂平板上18-24,h,培养形成无色半透明，表面光滑、湿润、隆起的菌落，直径2-3,mm。,有些菌株在营养琼脂平板上生长不良，形成,“,侏儒,”,菌落，加葡萄糖或甘油，生长良好，但易使菌株粗糙,呈干燥、无光泽、边缘不整齐。,光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀；粗糙型则产生沉淀，上层液透明。,生长温度在10-42，最适38；,pH4.5-9，,最适,pH,6.8-7.8；需氧或兼性厌氧。,生化特性,靛基质-，甲基红+，,v-p-，,柠檬酸盐反应,d，,产硫化氢，尿素酶反应-，还原硝酸盐，,-葡萄糖醛酸苷酶,d，,不能发酵乳糖，可以被噬菌体裂解。,抗原结构,（1）抗原构造,菌体抗原（,o）,：,不被乙醇、0.1%石炭酸所破坏。与特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢，不易摇散。,表面抗原（,K,抗原）：沙门菌中有三种,K,抗原，即,Vi,抗原、,M,抗原和5抗原。,可阻止,O,抗原被抗,O,血清所凝集，具有,O,不凝集性。常用于菌型鉴定。,M,抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊意义。,5抗原：,鞭毛抗原（,H,抗原）：经乙醇或酸处理后失去与特异性抗体的结合力。制备时，应用具有丰满鞭毛的菌种18-24,h,的培养物，加甲醛固定或60以下加热后即成,H,抗原。,H,抗原与抗,H,血清562,h,后，可出现疏松易于摇散的絮状凝集。,抗原结构,沙门菌的,H,抗原有两相，特异性高的称为第1相（特异相）抗原；特异性低的称为第2相（非特异相）抗原；多数沙门菌同一菌株，常可分离出两种,H,抗原的菌落，菌落的外观性状完全一样，但与相应抗体作凝集反应时则明显不同。具有两相抗原的称为双相菌，仅有一相抗原的则称为单相菌。,抗原结构,菌量大,活菌和菌体内毒素协同作用,小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜，由淋巴系统进入血液,潜伏期,8-48h,急性期，每克粪便中沙门菌多至,10,亿个,发病机理和症状,食物中毒的特征性症状,腹泻,恶心,腹痛,低烧,和,寒颤,有时,呕吐,、,头痛,、,倦怠,伤寒的典型症状,持续,发热,39-40,昏睡,症,剧烈,腹痛,（腹部,痉挛,）,头痛,食欲不振,出现扁平的玫瑰红色点状,红疹,供试品,供试液,预增菌,增菌,DHLS.S,EMB,MaCC,TSI,（,三糖铁琼脂）,氰化钾,赖氨酸脱羧酶试验,尿素酶试验,吲哚试验,血清学试验,半固体营养琼脂,革兰染色、镜检,报告,沙门菌常规检查法,（二）,沙门菌检验程序,预增菌,将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养，使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌培养基中。,一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用乳糖肉汤作预增菌液。以1：10的比例接种，18-24,h,35-37,。,预增菌培养基的选择,培养基,商品,缓冲蛋白胨水（,BPW,）,使用于所有商品,BPW+,酪蛋白,巧克力,乳糖肉汤,蛋和蛋制品，火腿，,pH6,的着色食品,乳糖肉汤,+,表面活性剂,7,或曲拉通,X-100,椰肉，肉，干燥或加工过的动物食品,乳糖肉汤,+0.5%,凝胶酶,凝胶,脱脂乳,+,亮绿,巧克力，糖，糖衣,胰蛋白胨大豆肉汤,香料、香草、干酵母,胰蛋白胨大豆肉汤,+0.5%,硫酸钾,洋葱和蒜粉等,水,+,亮绿,奶粉,选择性增菌,取1,mL,预增菌液转种至增菌培养基10,mL。37,24,h，,培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养基，我国与英国相同采用后者。美、日采用二者联用有助于提高沙门菌的检出率。,分离培养,选择性培养基：,DHL：,无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色,HE：,蓝绿或蓝色，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色,SS：,无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色,分离沙门菌应以出现单个菌落为准，否则应重新分离。,由于平板用前未烘干，或因分离不良菌落连片均须重新分离。,致病菌菌落一般在经3624,h,培养后，再放置室温2-3天后不发生变化，而非致病菌则继续增生、增厚，并带黄灰色，并产生臭味。,对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍,(1),初步鉴别试验：三糖铁琼脂,乳糖,:,蔗糖,:,葡萄糖,=10:,10,:,1,以酚红作指示剂,当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄色；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白胨而释放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色,细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化亚铁。,生化试验,斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色,斜面红色、底层黄色，无黑色,斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色,除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可出现上述反应。,吲哚试验：阴性,志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生,H,2,S,。,大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生,H,2,S,。,沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生,H,2,S,，多数产气。,下面照片所示,2-3-4,，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？,（2）赖氨酸脱羧酶试验,纯培养菌落,赖氨酸脱羧酶,产酸,含糖蛋白胨培养基,溴甲酚紫,产碱,(尸胺,),CO,2,对照为黄色,阳性为紫色,培养时间不超过四天,伤寒和鸡沙门菌除外，均为阳性,含糖蛋白胨培养基,紫色,(3),尿素酶试验,区别变形杆菌,具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生氨，培养基碱性，使酚红变红。沙门菌反应阴性,注意：用无尿素的培养基作对照,(4),氰化钾试验,沙门菌、志贺菌和埃希菌的生长受,KCN,抑制。,KCN,浓度为,1,：13300或1：10000。,沙门菌此反应阴性。,待检菌新鲜培养物,KCN,培养基,36,48h,不生长,铁卟啉,呼吸酶失活,注意：,氰化钾的浓度,控制接种量,试管封口严密,操作谨慎,用后的培养管加硫酸亚铁和氢氧化钾去毒,对照不加,KCN,动力检查,沙门菌周生鞭毛，能运动。,猪霍乱沙门氏菌（,S.gallinarum,）和鸡白痢沙门氏菌（,S.pullorum,）没有运动性,血清学凝集试验,（1）沙门菌属诊断血清,诊断血清规格：,10种1套：主要供伤寒、副伤寒沙门菌初步诊断用。包括,Vi,及,A-F,群多价血清各1种；,O,因子血清4种；,H,因子血清4种,26种1套：主要供沙门菌常见菌型定群和初步定型用。包括,Vi,及,A-F,群多价血清各1种；,O,因子血清9种；,H,因子血清15种,57种1套：主要供沙门菌常见菌型定型用。包括,Vi,及,A-F,群多价血清各1种；,O,因子血清16种；,O,复合因子血清各1种；,H,因子血清31种；,H,复合因子血清3种,144种全套：供各型沙门菌诊断用。包括诊断各型沙门菌用的各种多价,O、,多价,H,血清和单因子及复合因子血清,群别,菌种名称,O,抗原成分,A,甲型副伤寒杜雷佐变种,(,S.para Typhi A,),2,12,B,里丁沙门菌,(,S.reading,),4,12,C1,猪霍乱沙门菌,1350(,S.cholerae-suis,),6,7,C2,新港,(,纽波特,),沙门菌,(,S.newport,),6,8,D1,伤寒沙门菌,0901(,S.typhi,),9,12,E,伦敦沙门菌,(,S.London,),3,10,F,阿伯丁沙门菌,(,S.aberdeen,),11,A-F,群,O,多价血清的代表菌株,根据沙门菌菌型调查结果，95%以上的沙门菌都属于,A-F,六个,O,群，常见菌型不过20个左右，因此沙门菌检验，主要是对,A-F,群沙门菌做出初步鉴定。按常规方法选用,A-F,群多价,O,血清。,凝集试验方法,二者比例适当，菌量过多过少均不易观察到正确结果。,阳性反应通常在3,min,内发生。,血清效价低反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，放一个湿棉球，盖上皿盖，经约20,min,再观察结果。,出现凝集现象的待检菌培养物，应以灭菌的生理盐水溶液代替,A-F,多价,O,血清，与培养物混匀做对照试验，对照应无凝集现象，方可判为阳性反应。,A-F,多价,O,血清,稀释,接种环沾取2-3环,1.5,cm,0.5,cm,条形涂抹,待检菌,36,18-24h,接种环刮取少许,混匀,待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称自家凝集现象，这种现象多为,S-R,所致。,当,A-F,多价,O,血清凝集试验为阴性时，还应当考虑是否因为待检菌含有,Vi,抗原所致。,结果判断及报告,（1）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属,A-F,多价,O,血清凝集试验阳性反应，做出供试品检出沙门菌报告。,（2）生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属,A-F,多价,O,血清凝集试验阴性反应，做出供试品未检出沙门菌报告。,（3）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属,A-F,多价,O,血清凝集试验阴性反应；或生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属,A-F,多价,O,血清凝集试验阳性反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。,对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生化试验。,糖醇发酵试验,明胶液化试验,硝酸盐还原试验,甲基红试验,VP,试验,柠檬酸盐利用试验,半乳糖苷酶试验,苯丙氨酸脱氨酶试验,丙二酸钠试验,有机酸盐利用试验,甘油品红试验,明胶液化试验,被胶原酶分解,判断结果前，冰箱冷却。,明胶的用量与质量,肠杆菌科一般为阴性反应,假单胞菌一般为阳性,硝酸盐还原试验,待检菌,硝酸盐琼脂斜面,30s,培养物,-,萘胺,1mL,对氨基苯磺酸,1mL,阳性,36,18-24h,阴性,亚硝酸盐存在,硝酸盐没有被还原（真阴性反应）,假阴性结果,:,硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产物，如,NH,3,、,N,2,、,NO,或,N,2,O,和,羟胺。,需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。,肠杆菌科细菌皆为阳性反应,苯丙氨酸脱氨酶试验,待检菌新鲜培养物,10%三氯化铁,4-5滴,苯丙氨酸琼脂培养基,36,18-24h,苯丙酮酸,阳性,苯丙氨酸脱氨酶,接种培养物要多避免假阴性,立即观察，5,min,之内,变形杆菌阳性，肠杆菌科阴性,半乳糖苷酶试验,待检菌新鲜培养物,制成浓菌液,36,5,min,振摇使酶释放,阳性,生理盐水,甲苯1滴,ONPG0.25ml,37,20,min、3h、18h、24h,ONPG=,邻硝基酚,-D,半乳糖苷,阴性反应不变色,ONPG,为无色,pH7.0，,过酸假阴性，过碱假阳性,甘油品红试验,待检菌新鲜培养物,甘油品红肉汤培养基,36,8d,丙酮酸,乙醛,紫红色醌式化合物,品红,未接种培养基做对照,复红=品红,培养时间长,用于沙门菌属种间鉴别常见沙门菌阴性，乙型副伤寒结果不定,有机酸盐利用试验,待检菌新鲜营养肉汤培养物,有机酸盐培养基,36,14d,酸,沉淀,蓝色,每天观察,酒石酸,柠檬酸钠,黏液酸,溴香草酚兰,黄绿色,白色,0.5,ml,醋酸铅饱和水溶液,阴性反应一直为蓝色并有大量沉淀,沙门菌对右旋洒石酸盐多为阳性，志贺菌为阴性，培养时间长；沙门菌对左旋洒石酸盐反应不同，其他属为阴性,培养时间长,迟缓反应可分别确定发生期,培养基调中性,丙二酸盐利用试验,待检菌新鲜培养物,丙二酸钠培养基,36,48h,碳酸钠,绿色,溴香草酚兰,蓝色,先溶酵母膏和盐，调6.8后，再加指示剂,丙二酸钠为唯一碳源,黄色为产酸，阴性,任何蓝色均判为阳性,4,、注意事项,培养基,对照,挑取菌落,纯培养,严格按照规定进行,避免对环境造成污染,