第六章核酸的化学.ppt

,第六章 核酸的化学,核酸（,nucleic acid,）是生物特有的重要的大分子化合物，广泛存在于各类生物细胞中。,生物体中存在两类核酸：,核糖核酸（,DNA,）和脱氧核糖核酸（,RNA,）,。,DNA,主要存在于细胞核中，,RNA,存在于细胞质中。细胞 中的核酸通常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。,现已证明，储存遗传信息的物质是,DNA,，,基因是,DNA,分子中的一段特定的碱基排列顺序。,RNA,在蛋白质生物合成中起重要作用，而各种复杂的生命现象是通过蛋白质来表达的。,DNA,中储存合成蛋白质的遗传信息，必须通过,RNA,的作用才能转变成不同的蛋白质。,参与蛋白质合成的,RNA,有,3,类，,核糖体,RNA,（,rRNA,）、转移,RNA,（,tRNA,）、信使,RNA,（,mRNA,）。,rRNA,在细胞内与蛋白质结合构成核糖体（核蛋白体），,约占,RNA,总量的,80%,，,它是细胞内蛋白质的合成场所。,tRNA,在,蛋白质的生物合成中具有转运氨基酸和识别密码子的作用，,约占,RNA,总量的,15%,。,tRNA,的种类很多，合成蛋白质的每一种氨基酸都有相对应的一种或几种,tRNA,。,mRNA,在蛋白质的生物合成中起着传递遗传信息的作用，,约占,RNA,总量的,5%,。,在所有细胞中，蛋白质的合成都以,mRNA,为模板。,核酸广泛分布于各类生物细胞中，一般占细胞干重的,5%15%,。,在,真核细胞,中，,95%,98%,的,DNA,分布于,细胞核中，,DNA,与组蛋白结合成染色体的形式存在,，每个染色体含有一个高度压缩的,DNA,分子。,线粒体、叶绿体中也有少量,DNA,存在，但不与蛋白质结合,，且比细胞核中的染色体,DNA,要小得多。在,原核细胞,中，,DNA,存在于细胞质中的核质区，通常,只含有一个高度压缩的单纯,DNA,分子,，也称为染色体（但与真核细胞的染色体不同）。有关大肠杆菌的研究表明，它的染色体是一个,环状的,DNA,分子,。在某些细菌中还存在一些游离于染色体之外的小的,DNA,分子，称为,质粒,。,RNA,主要存在于细胞质中，约占总量的,90%,，细胞核中也有少量的存在，约占总量的,10%,。,病毒是非细胞形态的生物，主要由蛋白质和核酸组成。在病毒内部含有核酸，或是,DNA,，或是,RNA,，据此划分为,DNA,病毒和,RNA,病毒。,上述两大类核酸在细胞内的分布状况是与它们的功能相一致的。细胞中的,DNA,起着贮存和传递遗传信息的作用。细胞质中的,RNA,在核内接受了,DNA,的“指令”，到细胞质指导并直接参与蛋白质的合成。,第一节 核酸的组成,核酸的基本结构单位是核苷酸，,核酸是由几百甚至几千万个核苷酸聚合而成的生物大分子，所以又称,多聚核苷酸,。核酸经部分水解可产生核苷酸，如经完全水解则产生磷酸、碱基和戊糖。每分子核苷酸含有一分子磷酸、一分子含氮碱基和一分子戊糖。也就是说，,核酸的基本“元件”是碱基、戊糖和磷酸,。两类核酸的组成成分中，有相同的，也有不同的。含氮碱基是两种母体化合物嘌呤和嘧啶的衍生物。,核酸连续水解的降解产物,一、戊糖,核酸是按其所含戊糖不同而分为两大类的。,DNA,所,含的戊糖是,-D-2-,脱氧核糖，,RNA,所含的戊糖是,-D-,核糖。另外，,RNA,中还含有少量的修饰戊糖，即,D-2-O-,甲基核糖。核酸中的这些戊糖均以,-,呋喃型环状结构存在。,-D-,核糖,-D-2-,脱氧核糖,嘧啶,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,核酸中含氮碱基均为无色固体，熔点高，大多在,200,300,，在有机溶剂中溶解度很小，在水中溶解度也不大，一般溶于稀酸或稀碱。用,X,光衍射分析法已证明了各种嘌呤和嘧啶的三度空间结构。,嘧啶是平面分子，嘌呤也很接近平面，,但稍有翘折。,腺嘌呤分子的立体结构（单位为,nm,）,3,、磷酸：,核酸是含磷的生物大分子，,任何核酸都含有磷酸，所以核酸呈酸性，可与,Na,+,、多胺、组蛋白结合,。核酸中的磷酸参与形成,3,5-,磷酸二酯键，使核酸连成多核苷酸链。,以上三种基本“,元件,”再进一步连接，,碱基与戊糖以糖苷键形成核苷，核苷再与磷酸以磷酸酯键形成核苷酸，,核苷酸是核酸的基本结构单位，相当于“,部件,”。,DNA,RNA,嘌呤碱,腺嘌呤（,adenine,）,腺嘌呤（,adenine,）,（,purine bases,）,鸟嘌呤（,guanine,）,鸟嘌呤（,guanine,）,嘧啶碱,胞嘧啶（,cytosine,）,胞嘧啶（,cytosine,）,（,pyrimidine bases,）,胸腺嘧啶（,thymine,）,尿嘧啶（,uracil,）,戊糖,D-2-,脱氧核糖,D-,核糖,酸,磷酸,磷酸,两类核酸的基本化学组成,三、核苷与核苷酸,1,、核苷：,核苷（,riboside,）由戊糖和碱基缩合而成，并以糖苷键连接。糖环上的,C,1,与嘧啶碱的,N,1,或与嘌呤碱的,N,9,相连接。所以糖与碱基之间的连键是,N-C,键，称为,N-,糖苷键。应用,X-,光衍射分析证明，核苷中的碱基与糖环平面互相垂直。,2,、核苷酸：,核苷酸是核苷中戊糖环上的羟基与磷酸脱水生成的核苷磷酸酯。由核糖核苷形成的磷酸酯称为核糖核苷酸（简称核苷酸）；由脱氧核糖核苷形成的磷酸酯称为脱氧核糖核苷酸（简称脱氧核苷酸）,。,核苷酸有,2,-,核苷酸,、,3,-,核苷酸,和,5,-,核苷酸,；脱氧核苷酸有,3,-,核苷酸,和,5,-,核苷酸,。细胞内游离存在的核苷酸都是,5,-,核苷酸,，,RNA,在碱催化下水解可生成,2,-,核苷酸,和,3,-,核苷酸,。,P,P,P,P,P,P,P,P,常见（脱氧）核苷酸的结构和命名,鸟嘌呤核苷酸,（,GMP）,尿嘧啶核苷酸,（,UMP）,胞嘧啶核苷酸,（,CMP）,腺嘌呤核苷酸,（,AMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸,（,dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸,（,dGMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸,（,dCMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸,（,dTMP）,碱 基,核 糖 核 苷 酸,脱 氧 核 糖 核 苷 酸,腺嘌呤,(A),腺嘌呤核苷酸,（,adenosine monophosphate,AMP,）,腺嘌呤脱氧核苷酸,（,deoxyadenosine monophosphate,dAMP,）,鸟嘌呤,(G,鸟嘌呤核苷酸,（,guanosine monophosphate,GMP,）,鸟嘌呤脱氧核苷酸,（,deoxyguanosine monophosphate,dGMP,胞嘧啶（,C,）,胞嘧啶核苷酸,（,cytidine monophosphate,CMP,）,胞嘧啶脱氧核苷酸,（,deoxycytidine monophosphate,dCMP,）,尿嘧啶（,U,）,尿嘧啶核苷酸,（,uridine monophosphate,UMP,）,胸腺嘧啶（,T,）,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,（,deoxythymidine monophosphate,dTMP,）,常见的核苷酸,四、细胞内的其它核苷酸,生物细胞内除组成核酸的核苷酸外，还存在着一些游离的核苷酸，它们具有重要的生理功能。,1,、多磷酸核苷酸：核苷酸的磷酸基可进一步磷酸化，形成核苷二磷酸和核苷三磷酸，二者均称为多磷酸核苷酸。,细胞内的核苷三磷酸都是高能磷酸化合物。在生化反应中作为能量和磷酸基团的供体，以,ATP,最为重要。,ATP,中含有两个高能磷酸键。高能磷酸键水解时释放出的能量为,30kJ/mol,，而普通磷酸键能为,14kJ/mol,。生,物获得的能量可转换成,ATP,，当需要能量时，,ATP,中的高能键水解，将贮存的能量释放出来，可参与多种生物合成反应。,除核苷酸的磷酸基进一步磷酸化外，,5-,脱氧核苷酸也可以进一步磷酸化为脱氧核苷二磷酸和脱氧核苷三磷,酸，并都具有各自的生理功能。,2,、环化核苷酸：,环化核苷酸是核苷酸分子中的磷酸基团与核糖通过两个酯键环化而成的。研究较多比较重要的有,3,5-,环化腺苷酸（,cAMP),和,3,5-,环化鸟苷酸（,cGMP,）。,cAMP,cGMP,cAMP,和,cGMP,是,ATP,和,GTP,经腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶催化生成的，在生物细胞中广泛存在但含量很少。,cAMP,的,3,位酯键为高能磷酸键，水解后可释放,49.7kJ/mol,自由能。,cAMP,具有放大激素作用信号的功能，所以在细胞代谢调节中起重要作用。此外，,3,5 -,环鸟苷酸也是一种具有代谢调节作用的环化核苷酸，并有与,cAMP,相对抗的生理功能。,第二节 核酸的结构,一、核酸的一级结构,（一）核苷酸的连接方式：,RNA,和,DNA,分别由许多核苷酸和脱氧核苷酸按一定顺序连接而成的多核苷酸链。这种连接都是由一个核苷酸的,3-,羟基和另一个核苷酸的,5-,磷酸基以酯键相连，形成一个磷酸二酯键，这种共价键称为,3,，,5-,磷酸二酯键,。,RNA,和,DNA,都是由,3,，,5-,磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链。,多核苷酸链可以用简单的方法表示，如用竖线代表戊糖。,P,P,P,P,P,P,OH,OH,A,A,G,G,T,U,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,也可以用碱基序列表示核酸的一级结构，如，,AGCTAGC-,阅读方向从左到右，所表示的碱基序列是从,5,到,3,，核苷酸之间的连接键是,3,，,5-,磷酸二酯键。,在表示核酸酶的水解部位时，用,P,表示磷酸基团，当它放在核苷符号的左侧时，表示磷酸与糖环的,5-,羟基结合，右侧表示与,3-,羟基结合。如,pApCGpUp,表示水解后,C,的,3-,羟基连有磷酸基，,G,的,5-,羟基是游离的。,（二）,DNA,的一级结构：,DNA,的一级结构是由数量极其庞大的四种脱氧核糖核苷酸，即,脱氧腺嘌呤核苷酸,、,脱氧鸟嘌呤核苷酸,、,脱氧胞嘧啶核苷酸,和,脱氧胸腺嘧啶核苷酸,，通过,3,5-,磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。,由于核酸链的一端是一个游离的,5-,磷酸基，称,5-,端，另一端是游离的,3-,羟基，称,3-,端，因此,DNA,链是有极性的,。,由于生物的遗传信息贮存于,DNA,的核苷酸序列中，生物界物种的多样性就在于,DNA,分子四种核苷酸千变万化的不同排列之中，因此,DNA,序列问题一直是分子生物学家多年来要解决的重要的但比较困难的问题，但是随着分子生物学的发展，现在测定,DNA,的序列已经成为分子生物学实验室的一种常规方法。,（二）,RNA,的一级结构：,RNA,是细胞内核酸的第二种主要类型，它在把,DNA,中的遗传信息变成功能性蛋白的过程中起中介作用。,RNA,是,无分支,的,线形多聚核糖核苷酸,，主要由四种核糖核苷酸组成，即,腺嘌呤核糖核苷酸,，,鸟嘌呤核糖核苷酸,，,胞嘧啶核糖核苷酸,和,尿嘧啶核糖核苷酸,。这些核苷酸中的戊糖不是脱氧核糖，而是,核糖,。,RNA,分子中还有某些,稀有碱基,。,组成,RNA,的核苷酸也是以,3,5 -,磷酸二酯键,彼此连接起来的。但,RNA,分子比,DNA,分子小得多,（含几十至几千个核苷酸），且不象,DNA,那样都是双螺旋结构，而是,单链线形分子,。尽管,RNA,分子中核糖环,C,2,上有一羟基，但,并不形成,2,5 -,磷酸二酯键,。,天然,RNA,只有,局部区域为双螺旋结构,。这些双链结构是由于,RNA,单链分子通过自身回折使得互补的碱基对相遇，通过氢键结合形成,反平行右手双螺旋结构,（称为,茎,），,不能配对的区域形成突环,（,loop,，称为,环,），被排斥在双螺旋结构之外。每一段双螺旋区至少,需要有,46,对碱基才能保持稳定,，同样以氢键和碱基堆积力为稳定因素。一般说，,双螺旋区约占,RNA,分子的,50%,。,RNA,的这种结构称为,茎环结构,，是各种,RNA,的共同的二级结构特征。在此基础上,RNA,分子进一步扭曲折叠便形成更为复杂的三级结构。,1,、,tRNA,的一级结构,：,tRNA,把氨基酸转运到核糖体上，每种氨基酸都有一种或几种相应的,tRNA,，组成蛋白质的氨基酸有,20,种，但,tRNA,就有,500,多种，每种,tRNA,根据所转运的氨基酸来命名，如转运丙氨酸的，叫丙氨酸,tRNA,，写作,tRNAALa,。从目前已知的,tRNA,的一级结构来看，尽管组成它们的核苷酸数目不同，序列不同，但在一级结构上有共同点。,（,1,）相对分子质量很小，,M,r,为,25000,左右，平均沉降系数为,4S,。,（,2,）各种,tRNA,的链长都很接近，一般在,7393,个核苷酸之间，其中大多数在,76,个。,（,3,）有十几个位置上的核苷酸在几乎所有的,tRNA,中都是不变的，即为恒定核苷酸，如第,8,位的,U,，第,18,、,19,位的,G,等，这些恒定核苷酸对于维持三级结构和实现生物功能起着重要作用。,（,4,）各种,tRNA,的,3,末端都为,-,P,C,P,C,P,AOH,，用来接受活化的氨基酸。所以这个末端称接受末端；,5-,末端大多为,P,G-,，也有,P,C-,的。,（,5,）碱基组成中有较多的稀有碱基，每个,tRNA,分子中少则含有,2,个，多则含有,19,个修饰核苷酸，它们的功能还不清楚。,2,、,rRNA,及核糖体的结构：,rRNA,是核糖体的组成成分，约占核糖体重量的三分之二左右，是蛋白质生物合成的场所，一般由,1205000,个核苷酸组成。核糖体由大小两个不同的亚基组成。,虽然原核生物和真核生物的核糖体蛋白质和,rRNA,的差异很大，但核糖体总体结构很相似。,rRNA,修饰碱基的含量比,tRNA,少的多，其显著特点之一是甲基化核苷的存在。,3,、,mRNA,的一级结构：,mRNA,是蛋白质合成的模板产生于细胞核与线粒体，然后进入细胞质及核糖体，种类很多，每一种的相对分子质量及碱基序列都不相同。,原核细胞与真核细胞中的,mRNA,在结构上的区别：原核细胞,mRNA,的,5,端有无,帽子结构,，真核细胞,mRNA,的,5,端有帽子结构。,帽子结构的作用,：,（,1,）防止,mRNA,被核酸酶降解；（,2,）为,mRNA,翻译活性所必须；（,3,）与蛋白质合成的正确起始有关；（,4,）协助核糖体与,mRNA,结合，使翻译作用在,AUG,起始密码子处开始。,原核生物,mRNA3,端一般没有或仅有少于,10,个多聚腺苷酸结构，真核生物,mRNA3,端一般都有多聚核苷酸，有一条大约有,200,个腺苷酸残基连续组成的多聚,腺苷酸链，常称为,尾巴结构,。,尾巴结构的作用,（,1,）,可保护,mRNA,免受核酸外切酶的作用；（,2,）与,mRNA,的翻译活性有关；（,3,）与,mRNA,顺利通过核膜进入胞质有关；（,4,）与,mRNA,从细胞核转移到核糖体有关。,二、核酸的空间结构,（一）,DNA,的空间结构,1,、,DNA,的二级结构：,DNA,的二级结构是由两条脱氧核苷酸链形成的双螺旋结构。,DNA,双螺旋结构的特点：,（,1,）,两条反响平行的多核苷酸链形成右手螺旋,（,2,）,大沟和小沟,DNA,的两条多核苷酸链之间有两条螺旋型的凹槽。对,DNA,和蛋白质的相互识别很重 要。,（,3,）碱基、糖和磷酸的位置。,（,4,）,碱基对,A,与,T,配对，形成,2,个氢键；,G,与,C,配对，形成,3,个氢键。,（,5,）,螺旋参数,双螺旋的直径是,2nm,，两个相邻碱基对之间的距离,(,碱基堆积距离）是,0.34nm,，每,10,个核苷酸形成螺旋的一转，每一转的高度（螺距）,3.4nm,。,（,6,）,核苷酸序列,DNA,双螺旋结构对核苷酸链上碱基的序列无任何限制，每链可含腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和胸苷酸等,4,种核苷酸，但各种核苷酸的排列顺序是极复杂和多样化的。,维持,DNA,双螺旋结构稳定性的,3,种作用力：,（,1,）,氢键,A,、,T,之间有两个氢键，,G,、,C,之间有,3,个氢键，与,A,、,T,对比，,G,、,C,更稳定，因此双螺旋结构的稳定性与,G+C,的百分含量成正比。,（,2,）,碱基堆积力,碱基（嘌呤和嘧啶）形状扁平，是疏水性的，分布于螺旋的内侧，大量临近碱基对的堆积，使其内部形成了一个强大的疏水区，与介质的水分子隔开，这种现象称,疏水相互作用,。此外，堆积的碱基对间存在范德华力。因此,碱基堆积力的实质是疏水相互作用和范德华力,，对维持,DNA,双螺旋结构起主要作用。,（,3,）,离子键,磷酸基上的负电荷与介质中阳离子之间形成的离子键，有效地屏蔽磷酸基之间的静电斥力。,2,、,DNA,的三级结构：,指双螺旋结构的,DNA,分子通过进一步卷曲和折叠所形成的特定构象。,真核生物的染色体,DNA,多数为,双链线形分子,，但细菌的染色体,DNA,、某些病毒的,DNA,、细菌质粒、真核生物的线粒体和叶绿体的,DNA,为,双链环形,DNA,。,当,DNA,分子在溶液中自由存在时，双螺旋呈松弛状态，每,10,个核苷酸螺旋上升一圈，此时双螺旋处于最低能量状态，如果将这种正常的双螺旋分子额外多转几圈或少转几圈，就会使螺旋内部的原子偏离正常的位置，其结果在双螺旋分子存在一种额外的张力；如果双螺旋末端是开放的，这时张力可以通过链的回转释放出来，,DNA,恢复正常的双螺旋状态，如果,DNA,分子是环状的张力不能释放，内部原子只能重排，,DNA,就会方式扭曲，,DNA,双螺旋的扭曲就称为,超螺旋,DNA,。,超螺旋,DNA,有,负超螺旋,和,正超螺旋,两种。自然界存在的超螺旋,DNA,绝大多数是负超螺旋。,绝大部分双链环形,DNA,可进一步扭曲成,超螺旋,DNA,(,又叫,共价闭环,DNA,),。若超螺旋,DNA,的一条链断裂，分子将释放扭曲张力，形成,松弛环形,DNA,（又叫,开环,DNA,）。若超螺旋,DNA,的两条链都断裂，就会转化为,双链线形,DNA,。,（二）,RNA,的空间结构：,RNA,的碱基组成不像,DNA,那样有,A=U,和,G C,的规律，大多数天然,RNA,是一条单链，由于单链可以发生自身回折，使一些可配对的碱基相遇，形成,A=U,和,G C,，构成局部双螺旋区域，叫,臂和茎,，不能配对的碱基形成,单链突环,，,RNA,中约有,4070%,的核苷酸参与双螺旋的形成，所以,RNA,分子可以形成,多环多臂,的二级结构,1,、,tRNA,的二级结构：,1965,年,R.W.Holley,等人测定了酵母丙氨酸,tRNA,的一级结构后，根据碱基序列的测定和碱基配对原则，提出了酵母,tRNA,的二级结构模型为,三叶草形,。迄今为止发现的,500,余种,tRNA,都符合三叶草的模型，但也有少数例外。,三叶草结构的主要特征：,（,1,）,tRNA,一般由,4,臂,4,环组成。,（,2,）上臂（,）是由,tRNA3,端和,5,端附近的,7,对碱基所组成，称氨基酸接受臂，其,3,端的,C-C-A,核苷酸段是接受氨基酸的部位。,(3),下臂（,）与反密码子环相连，环的顶端有由,I-,G-C3,个核苷酸组成的反密码子，此臂称反密码子臂。是识别,mRNA,上密码子的机构。,（,4,）左臂为而氢尿嘧啶臂，与含二氢尿嘧啶的环相连。,（,5,）右臂（,）为,T,C,臂，与一个含有,T,C,序列的环或一个可变环相连，可变环的核苷酸的数目变化较大，随不同的,tRNA,而异。,tRNA,中含有,2021,对碱基对，由于其双螺旋结构所占比例甚高，对称性强，故,tRNA,的稳定性甚强。,2,、,tRNA,的三级结构：,tRNA,的 三级结构很像倒写的,L,氨基酸臂和,T,C,臂沿同一轴排列，形成,12bp,的连续双螺旋，在与之垂直的方向，反密码子臂和,D,臂沿同一轴排列，,D,环和,T,C,环构成倒,L,的转角，两环之间的氢键和碱基堆积力稳定了转角的构象。,3,、,rRNA,的二级结构：,也是三叶形。从大肠杆菌核糖体分离出来的,rRNA,有,23S,、,16S,和,5S,三种；从真核细胞分离出来的,rRNA,有,5S,、,5.8S,、,18S,和,28S4,种。不同的,rRNA,的碱基比例和碱基序列各不相同，但分子结构基本上都是由部分双螺旋和部分单链突环相间排列而成。如大肠杆菌,5SrRNA,的形状。,第三节 核酸的性质,核酸的性质是由核酸的组成和性质决定的，,DNA,与,RNA,的许多性质与组成它们的核苷酸相似，但也有某些特殊的性质。,一、核酸的物理性质,DNA,是白色纤维状固体，,RNA,是白色粉末或结晶。,它们都是极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，核酸的钠盐比核酸溶解度大。,在生物体内，核酸与蛋白质形成核蛋白，,DNA,核蛋白易溶于,2moL/L,的,NaCI,溶液中，难溶于,0.14moL/L,的稀,NaCI,溶液，利用二者在,NaCI,溶于中溶解性的不同，可以分离,DNA,和,RNA,。,DNA,是相对分子质量很大的线性分子，因此，,DNA,溶液有很大的黏度；而,RNA,的相对分子质量较小，其黏度比,DNA,小。,核酸分子中有嘌呤和嘧啶碱基，碱基的共轭体系强烈吸收,260290nm,波段紫外光，其最大吸收峰在,260nm,。利用这一性质，可以定性和定量测定核酸。,二、核酸的化学性质,(,一,),核酸的两性性质,核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱性的碱基，故为两性电解质，可发生两性解离。,但磷酸的酸性较强，在核酸中除末端磷酸基团外，所有形成磷酸二酯键的磷酸基团仍可解离出一个,H,+,，其,pK,为,1.5,；而嘌呤和嘧啶碱基为含氮杂环，又有各种取代基，既有碱性解离又有酸性解离的性质，解离情况复杂，,但总的来看，它们呈弱碱性。所以，核酸相当于多元酸，具有较强的酸性，当,pK4,时，磷酸基团全部解离，呈多阴离子状态。,核酸是具有较强的酸性的两性电解质，其解离状态随溶液的,pH,而改变。当核酸分子的酸性解离和碱性解离程度相等，所带的正电荷与负电荷相等，即成为两性离子，此时核、酸溶液的,pH,就称为等电（,isoelectric point,简称,pI,）。核酸的等电点较低，如酵母,RNA,的,pI,为,2.02.8,。根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，把,pH,调至,RNA,的等电点，可使,RNA,从溶液中沉淀出来。,根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是,电泳（,electrophoresis,）,。凝胶电泳可算是当前核酸研究中最常用的方法了。它有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的凝胶电泳有,琼脂糖（,agarose,）凝胶电泳,和,聚丙烯酰胺（,polyacrylamide,）凝胶电泳,。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率很高。,（二）核酸的变性和复性,1,、变性：,核酸的变性指核酸双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力破坏，变成单链的无规则线团，使核酸的某些光学性质和流体力学性质发生改变，有时部分或全部生物活性丧失，并不涉及共价键的断裂。,缓慢冷却,加热,天然,DNA,变性,DNA,当将,DNA,的稀盐溶液加热到,80100,时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，形成无规则线团。一系列物化性质也随之发生改变：,粘度降低，浮力密度升高等，同时改变二级结构，有时可以失去部分或全部生物活性,。,DNA,变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积已不存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，这样就使得变性后的,DNA,对,260nm,紫外光的吸光率比变性前明显升高（增加），这种现象称为,增色效应,（,hyperchromic effect,）。常用增色效应跟踪,DNA,的变性过程，了解,DNA,的变性程度。,2,、复性：,变性,DNA,在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合（,reassociation,）成为双螺旋结构的过程称为,复性,（,renaturation,）。,DNA,复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性也可以得到部分恢复。复性过程基本上符合二级反应动力学，其中第一步是相对缓慢的，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，首先形成双螺旋。第二步快得多，尚未配对的其他部分按碱基配对相结合，象拉锁链一样迅速形成双螺旋,。,