基因芯片技术-.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因,芯片技术,Gene chips,芯片实验室,（,Lab-on-a-chip),微流体芯片（微流控芯片）,（,Microfluidic chip,）,样品分离芯片,生物芯片,（,biochip),微阵列芯片：,基因芯片（,DNA,芯片）,蛋白质芯片,组织芯片,细胞芯片,微流体芯片（微流控芯片）,生物样品制备芯片,核酸扩增芯片,毛细管电泳芯片,生物芯片的概念,生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的,微型分析系统,，以实现对组织细胞中,DNA,、蛋白质及其他生物组分,的快速、高效、敏感地处理与分析。,生物芯片,分子生物学,统计学,计算机科学,化学,物理学,微电子学,Research Integration,基因,芯片的分类,原位合成芯片,（,In situ synthetic,GeneChip,）,Affymetrix,公司,DNA,微阵列,（,DNA microarray,）,斯坦福大学,Patrick Brown,研究小组,合成,DNA,芯片,Affymex Inc.,显微光蚀刻,寡聚核苷酸合成,*,*,Synthetic Chips,ATCGTCCAGTACT.,密度大于,1000/,cm,2,Affymetrix Inc.,原位,合成,芯片,DNA,微阵列,DNA,微集芯片,Stanford Univ.,Patrick Brown,显微打印头,单链,DNA/cDNA,片段,Microarray Printing,DNA,微集芯片,基本原理,DNA,:,double helix structure,denaturation,renaturation,Denature,Hybridize,Southern,Fish,基因芯片技术,基本原理,基本原理：,核酸分子杂交，即依据,DNA,双链,碱基互补配对,、,变性,和,复性,的原理,大规模集成的固相杂交,以大量已知序列的寡核苷酸、,cDNA,或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,基因芯片的,制备与检测原理,Biological,Sample,Analyze data,Scanner,microarray,“,Hybridize”,arrayer,Microarray fabrication,Sample preparation,Molecular hybridization,Detection and analysis,1.,探针,的设计与制备,2.,支持物,的选择与处理,3.,芯片的制作,（,1,）原位合成芯片的制作,（,2,）,DNA,微阵列的制作,（一）芯片的制备,1.,探针的设计与制备,cDNA,探针,100,+,bp,寡核苷酸（,Oligo,）探针,8-12 nt,20-30 nt,50-70 nt,2.,支持物的选择与处理,实性材料：,硅芯片、玻片和瓷片等,膜性材料：,聚丙烯膜，尼龙膜，硝酸纤维素膜,支持物的处理：,氨基化,醛基化,3.,原位合成芯片的制备,显微光蚀刻技术,压电打印法,分子印章法,显微光蚀刻技术,4.DNA,微阵列的制备,喷墨打印：非接触式,针式打印：接触式,基因芯片制作的三种技术,芯片的制备,Gene probes,（,cDNA,、,DNA,）,substrate,Ready-to-use,microarray,Oligo probes,A,G,C,T,or,arrayer,DNA,芯片图解,Microarray:,top view,Microarray:,side view,Probes,Adhesion layer,Substrate,样品核酸的分离纯化,样品核酸的扩增、标记：,反转录标记,随机引物延伸标记,PCR,标记,（二）,样品的准备,Sample cells,Extract RNA or DNA,2)RT or PCR amplification,3)Fluorescent labeling,Reference cells,Sample ready,combine,Labeled RNA or DNA(Sample),Labeled RNA or DNA(Reference),2),1),3),1),2),3),基因表达谱双色标记,样品的标记,标记方法：,反转录标记,随机引物延伸法,PCR,样品的标记,标记分子：,放射性同位素,生物素,荧光分子：,Cy3,、,Cy5,FITC,、,TRITC,（三）,分子杂交,1)hybridize,Apply sample,2)rinse,Hybridization,The labeled target is selectively bound to complementary probes,Note:know the location of each probe on the array,B,B,B,B,B,B,B,x 12,000,传统杂交方法,手工,固定样品,标记探针,单个探针,费时、,1-2,周,费力、需同位素,不易自动化,基因芯片技术,可批量,固定探针,标记样品,大量探针,快速、平行化,易于自动化,荧光标记,基因芯片与传统杂交技术比较,（四）,检测分析,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,Scanner,芯片的扫描,图像处理,Detector 1,Detector 2,False-color differential image,图像分析,(1)find spots,(2)quantitate spot intensities,图像分析,cy5,cy3,（,3,）,calculate ratios,杂交结果的聚类分析,表达谱聚类分析软件,Treeview,基因芯片技术主要步骤,基因芯片技术的特点,高通量,集成化,微型化,三、基因芯片技术的应用,基因,芯片技术,应用原理,2.,基因表达谱分析,基因突变检测及多态性分析,DNA,序列分析,1.,基因检测分析,基因芯片技术测序原理,BRCA1,基因芯片与突变检测,G CA A A C G A G,G,C A A A A G T C C,T T T G C T C,A,G T T T T C A,T T T G C T C,C,G T T T T C A,T T T G C T C,G,G T T T T C A,T T T G C T C,T,G T T T T C A,T T G C T C A,G,T T T T C A G,T T G C T C A,C,T T T T C A G,T T G C T C A,A,T T T T C A G,T T G C T C A,T,T T T T C A G,靶分子,叠瓦式探针设计,BRCA1,基因芯片与突变检测,样品 检测阳性,15,例,14,对照 检测阳性,20,例,0,WT,G/A,杂合突变,A/A,纯合突变,基因表达谱,gene expression profile,基因表达,mRNA,的水平反应了在一定环境、一定细胞类型、一定细胞生长阶段和一定细胞状态下的基因功能信息。,是对上述特定状态下哪些基因表达，表达水平如何，转录产物的结构形式如何等等信息的完整表述，包括每种组织细胞中的基因表达谱、细胞不同发育阶段的基因表达谱、正常和病理状态下的基因表达谱，治疗条件下的基因表达谱等等。,基因表达谱分析原理,肿瘤基因表达谱分析与肿瘤的分子分型,Molecular Classification of Cancer:Class Discovery and Class Prediction by Gene Expression Monitoring,Golub T R,Slonim D K,Tamayo P,et al,.,Science,1999,286,531537,Molecular Classification of Cancer,leukemias:,acute lymphoblastic leukemia(ALL),acute myeloid leukemia (AML),38bone marrow samples,RNA isolation,hybridized to high-density oligonucleotide microarrays(Affymetrix,containing probes for 6817human genes),24of 25samples,10of 13samples,生物战剂检测,临床疾病的,基因诊断,法医学鉴定,药物研究开发,动植物检疫,基因组研究,后基因组计划,生物信息学,DNA,芯片,基因芯片技术的应用领域,