SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验七,SDS-PAGE,电泳法测定,蛋白质分子量,实验目的,学习并掌握,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法和,测定蛋白质分子量的技术,实验原理,1,、蛋白质混合样品中各蛋白质组分的,分子大小,和,形状,以及,所带电荷多少,等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量,十二烷基硫酸钠（,SDS,），,形成蛋白质,-SDS,复合物，这种复合物由于结合了大量的,SDS,，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的,负离子团块,，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的,分子量大小,，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,2,、当蛋白质的分子量在,15000,200000,之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：,10,M,r,=,bm,R,+K,（式中：,M,r,为蛋白质分子量，,m,R,为相对迁移率，,b,为斜率，,K,为截距。在条件一定时，,b,和,K,均为常数。）,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,实验试剂,（,1,）标准蛋白质（低分子量,Marker,）,蛋白质名称,分子量,兔磷酸化酶,B,97400,牛血清白蛋白,66200,兔肌动蛋白,43000,牛碳酸肝酶,31000,胰蛋白酶抑制剂,20100,鸡蛋清溶菌酶,14400,待测蛋白质：,牛血清白蛋白、人血清蛋白,（,2,）凝胶试剂,1,）,30%,（,W/V,）丙烯酰胺,30g,丙烯酰胺，,0.8g,甲叉双丙烯酰胺，溶于,100ml,蒸馏水中，储于,4,暗处，,一个月内可使用,。,2,）,1mol/L,，,pH8.8Tris-HCl,缓冲液,Tris,21g,溶于蒸馏水，用浓,HCl,调至,pH8.8,蒸馏水定容,1000ml,。,3,）,1mol/L,，,pH6.8,Tris-HCl,缓冲液,Tris21g,溶于蒸馏水，用浓,HCl,调至,pH6.8,定容,1000ml,。,4,）,10%,（,W/V,）,SDS,5,）,10%,（,W/V,）过硫酸铵（,现用现配,）,6,）,TEMED,(N,N,N,N-,四甲基乙二胺,),（,3,）,10,电极缓冲液（,pH8.3,）,Tris30.3g,，甘氨酸,144.2g,，,SDS10g,，溶于蒸馏水并定容至,1000ml,。使用时,10,倍稀释。,（,4,）,2,样品稀释液,SDS 500mg,，巯基乙醇,1ml,，甘油,3ml,，溴酚蓝,4mg,，,1mol/L,，,pH6.8Tris-HCl 2ml,，用蒸馏水定容至,10ml,。按每份,0.5-1.0ml,分装，,-20,贮存。以此液制备样品时，样品若为固体，应稀释,1,倍使用；样品若为液体，则加入于样品等体积的原液混合即可。,（,5,）染色液,（,6,）脱色液,10%,（体积分数）甲醇,10%,（体积分数）冰醋酸,脱色需,310h,，其间更换多次脱色液至背景清楚。,0.1%,（质量分数）考马斯亮蓝,R250,40%,（体积分数）甲醇,10%,（体积分数）冰醋酸,染色,12h,或过夜。,实验器材,玻璃板，梳子,电泳槽，电泳仪,实验步骤,1.,装板：,将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个,“,夹心,”,凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液,。,A,液（分离胶缓冲液）,4.5 ml,C,液（交联剂）,7.5 ml,H,2,O,（,ml,）,5.9 ml,AP,液（,10%,过硫酸铵）,100,l,TEMED,（,l,）,30,l,2.,制备分离胶：,(18ml),从冰箱中取出制胶试剂，应平衡至室温。按下表现配制所需浓度的分离胶。,配制,12.5%,分离胶,3.,制备浓缩胶,：,(7.55ml),B,液（浓缩胶缓冲液）,2.0 ml,C,液（交联剂）,1.0 ml,H,2,O,4.5 ml,AP,液（,10%,过硫酸铵）,60,l,TEMED,20,l,配制,3%,浓缩胶,4.,凝胶液的灌注和聚合,用移液枪将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加满蒸馏水。,20,min,后，待分离胶凝固，倒出蒸馏水，用滤纸吸干，加浓缩胶，将梳子插入胶液顶部,20min,凝固。,5.,煮样，加样：,用移液枪依次在各个样品槽加样。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,牛血清白蛋白,人血清蛋白,牛血清白蛋白,人血清蛋白,Marker,牛血清白蛋白,人血清蛋白,牛血清白蛋白,人血清蛋白,Loading buffer:,样品,=1,：,1,煮样，上样量每孔,40 l,6.,电泳：,连接正、负极，打开电源，电流,50mA,。保持电流强度不变。待指示剂染料靠迁移至下沿,0.5cm,处停止电泳，需,2,3h,。,7.,剥胶：,电泳结束后，取下凝胶膜，卸下凝胶膜上的橡胶框，用镊子将短玻璃撬开后取出凝胶板。,8.,染色：,弃去固定液，加入染色液。染色,15 min,。,9.,脱色：,染色完毕，倾出染色液，换,2,3,次脱色液，脱色一昼夜。,10.,观察：,11.,绘制标准曲线，求待侧样牛血清白蛋白的分子量。,思考题,1,、利用,SDS-,聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白质的分子量与利用凝胶层析测定蛋白质的分子量有何不同？,2,、,SDS,在该电泳方法中的作用是什么？,结 束！,