DB64∕T 1725-2020 牛轮状病毒抗体竞争性酶联免疫吸附试验操作规程(宁夏回族自治区).pdf

ICS 11.220 B41 电飞hJ飞mvDB 64/ T1725-2020 试验Operating regulation for competitive enzyme linked immunosorbent assay of Bovine rotavlrus 2020一05-18发布2020 一08-18实施宁夏回族自治区市场监督管理厅发布目IJ本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由宁夏回族自治区农业农村厅提出归口并实施。本标准由宁夏农林科学院动物科学研究所起草。D864/ T1725-2020 本标准主要起草人:康晓冬、李知新、高海慧、于洋、刘溪源、王建东、高飞涛、张奎举、宣小龙、梁小军、薛伟、王川|、厉龙、张俊丽、杨炜迪。I D864/ T1725一-2020牛轮状病毒抗体竞争性酶联免疫眼附试验操作规程1 范围本标准规定了牛轮状病毒抗体竞争性酶联免疫试验操作的技术规范。本标准适用于牛血清牛轮状病毒抗体的检测，可用于该病的实验室检测、诊断和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682一2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19489-2008 实验室生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 牛轮状病毒(8ovinerotavirus, 8RV) 牛轮状病毒属于呼肠病毒科轮状病毒属，可引起棋牛的急性肠道感染。3.2 酶联免疫吸附试验(EnzymeI inked immunosorbent assay, ELISA) 本规程采用竞争ELISA法。其原理是将纯化的牛轮状病毒重组蛋白抗原包被在固相载体上，加入样品，血清抗体与抗原特异性结合，洗板后加入酶标单克隆抗体(二抗孵育。如果血清样品中含有抗体，后面加入的酶标单抗将无法与板上包被抗原结合。洗板后，将直接使用的底物/显色剂溶液加入各孔。孵育后，终止颜色反应并测量OD值。颜色反应的显色强度与样品中病毒抗体含量成反比。4 牛轮状病毒病概况牛轮状病毒病是由轮状病毒引起的多种幼龄动物和婴幼儿的急性胃肠道传染病，以精神萎顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征。潜伏期18hr-.-96h，多发生于15日龄r-.-90日龄的核牛。春、秋两季发病较多。病毒存在于肠道，随粪便排出体外，经消化道感染。轮状病毒有交互感染的作用，可以从人或一种动物传给另一种动物，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。另外，本病有可能通过胎盘传染给胎儿。5 牛轮状病毒竞争酶联免疫吸附试验1 OB64/ T1725-2020 5. 1 材料准备牛轮状病毒竞争酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒保存温度为20C80C。试剂盒内应包括如下物品:包被有纯化的牛轮状病毒重组蛋白抗原的96孔微孔板、酶标结合物、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗液、TMB底物溶液、终止液。5.2 仪器与设备a) 酶标仪，单波长为450nm;b) 振荡器;c) 洗板机:d) 冰箱:e) 3TC恒温培养箱:f) 8道或12道移液器，容量为10L-100L; g) 单道移液器，容量为20L200L、100L-1000L、1mL10 mLo 5.3 试剂的准备工作洗液的配制:首先将20倍浓缩洗液置于室温200C250C，待浓缩液中的晶体全部溶解后，将浓缩洗液用蒸馆水或去离子水按1:20稀释，混匀备用。稀释用蒸馆水应符合GB/T6682的要求。5.4 检测样品无菌采集牛静脉血2mL3mL，自然凝固1h-拙，1500gr-.-2000rmp离心5min，收集血清于1.5 mL离心管中。5.5 操作程序使用前将所有试剂恢复至室温200Cr-.-250C，轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。5.5.1 取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测样品的条数。未使用的微孔板条可用锡销纸包好，保持干燥与密封，20C - 8 oC保存。5.5.2 加样:吸取100L阴性对照到A1和B1孔。吸取100L阳性对照到C1和D1孔。吸取100L样品稀释液到样品孔中，然后再加入10L样品，振荡混匀。5.5.3 感作:将微孔板封板后，370C孵育30min。5.5.4 洗涤:弃去微孔板中液体，用300L左右的洗涤液洗板6次。每次洗涤后，应甩去每个板孔中的液体，要防止微孔板出现干燥现象，避免孔内产生气泡，在最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体。5.5.5 加酶标结合物:每孔加入100L酶标记物，振荡混匀。5.5.6 感作和洗涤:将微孔板密封后，370C孵育30min。按步骤5.5.4洗涤。5.5.7 加底物:每孔加入100L的TMB溶液。5.5.8 感作37oC避光孵育15min。5.5.9 加终止液:每孔加100L的终止液终止反应。5.5.10 测定吸光值(OD值):酶标仪预热15min，在加入终止液5min内读取450m丑波长的吸光度值(OD450)。5.6 实验有效性检测2 DB64/ T1725-2020 只有当满足以下条件时检测才有效:阴性对照(A1和B1孔)的平均值应该大于1.4，阳性对照(C1和D1孔)的平均值应小于0.205. 7 结果计算样品系数(S/N)值按如下方法计算:S/N值=样品OD值阴性对照平均OD值。5.8 结果判定被检样品S/N值二0.5，判定为牛轮状病毒抗体阴性。被检样品S/N值0.5，判定为牛轮状病毒抗体阳性。3 DB64/ T1725-2020 附录A(资料性附录试剂的自己制A. 1磷酸盐缓冲液CO.01mol/L，PH7.4, PBS) 4 氯化纳磷酸二氢纳磷酸氢二纳氯化饵加蒸馆水至8g O.2g 2.9g O.2g 1000mL