工具酶【可编辑的PPT文档】.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子克隆技术常用的工具酶,基因重组,基因组,DNA,目的基因,PCR,限制性内切酶,目的基因,基因载体,重组体,(,复制子,),基因重组,工欲善其事，必先利其器,核 酸,核酸水解酶类,核酸合成酶类,核酸修饰酶类,核酸内切酶,核酸外切酶,DNA,聚合酶,RNA,聚合酶,DNA,连接酶,甲基化酶,核苷酸激酶,核苷酸转移酶,磷酸酶,第一节 限制性核酸内切酶,5,5,G C A A T G C T T A G C C A T,C G T T A C G A A T C G G T A,核酸外切酶,核酸内切酶,核酸外切酶,3,3,5,5,G C A,A G C T,T T A G C C A T,C G T,T C G A,A A T C G G T A,限制性核酸内切酶,AGCT,AGCT,AGCT,AGCT,AGCT,NNNNN,NNNNNNNNNNNNNNN,NNNNNNN,NNNNNNNN,NNNNNNNNN,NNNN,NNN,Alu,（,+,）,（,-,）,电泳,I,II,I,II,限制性核酸内切酶,能在特异位点（酶切位点）上催化双链,DNA,分子的断裂,产生相应的限制性,DNA,片段。,切割不同来源的,DNA,分子，而产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。,存在于细菌体内。,一、限制酶概念提出的背景,20,世纪,30,年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如,E coli,K,株的噬菌体只能感染,E coli,K,株，不能感染其它,E coli,株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。,1962,年，,W,Arber,提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有,2,种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能,识别并切断外来,DNA,分子的某些部位,，使外来,DNA,失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为,限制性核酸内切酶,.,E coli K,株,噬菌体,E coli K,株,其他,E coli,菌株,限制现象,限制性内切酶,能识别并切断外来,DNA,分子的某些部位，使外来,DNA,失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。,修饰与限制系统,是细菌保护自身不受外来,DNA,入侵的防御系统,NNNNNNNNNNNN,GGATCC,NNNNNNNNNNNNNNN,Bam H,5,3,NNNNNNNNNNNN,AGCT,NNNNNNNNNNNNNNN,Alu,5,3,二、,限制性核酸内切酶的,分类,自,1968,年首次从,E coli,K,株和,株中分离到限制酶，继后不断发现和分离到新的限制酶。,仅,2003,年,1-4,月份就有,150,余种新的酶被登录入网，至,2003,年,04,月,19,日,REBASE(The Restriction Enzyme Database),收集的编号已有,7096,种；其中,类酶有,3845,种,根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为,I,，,，,三大类。,I,类：系复合功能酶，即对双链,DNA,有切割、甲基化、解旋的活性,不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。,类：基因工程的工具酶。,类,：,切割位点不在识别位点，一般离识别位点,25 bp,27 bp,，对,分子克隆操作亦无实用意义。,I,类限制酶,由,3,个不同的亚基组成，这,3,个亚基分别由宿主特异,DNA,hsdS,，,hsdM,，,hsdR,基因编码，,反应条件需要,Mg2+,、,ATP,和,S-,腺苷蛋氨酸，系复合功能酶，即对双链,DNA,有切割、甲基化、解旋的活性，并有水解,ATP,的,ATP,酶活性。,一般在识别位点外的,400 bp,7000 bp,进行非特异切割，产生非特异片段，不适用于基因工程。,I,类限制酶只在肠道菌中发现。,2,个亚基组成，反应条件需要,Mg2+,和,ATP,，,对双链,DNA,亦有切割和甲基化修饰功能，但无解旋酶和,ATP,酶活性，识别序列不对称。修饰时仅在识别序列的一条链上甲基化，另一条链没有甲基化。,虽能在,DNA,链上的特异位点切割，但切割位点不在识别位点，一般离识别位点,25bp,27bp,，对分子克隆操作亦无实用意义。,类限制酶,类限制酶为单链多肽，反应条件只需,Mg2+,，对,DNA,的水解有很强的特异性。它要求,严格的识别序列和切割位点,，切割位点所要求的序列中有一个碱基的变异、缺失或修饰都不再能被水解。,其中大多数可用于分子克隆，使得分子生物学的实验结果具有高度的精确性、可重复性，被誉为分子生,物学家的手术刀。,类限制酶,类限制,-,修饰系统的限制酶活性与,甲基化酶,活性分别是不同的酶。,相对应的限制酶与修饰酶虽然识别,DNA,的同一序列，但从已知序列的,50,多对限制,-,修饰系统酶中，,2,种酶的氨基酸序列没有同源性；,不同的,类限制酶之间，除少数同裂酶外，亦没有同源性。,限制酶的命名是采用,Smith,和,Athens,提议的方案，即,第个,1,字母取自它来源细菌属名的第,1,个字母，大写,第,2,，,3,二个字母取自来源细菌种名的头,2,个字母，小写,如果它的来源菌还有株系，则有第,4,个字母；,最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号,。,前三个字母用斜体表示,如,Hin,d,代表从流感噬血杆菌,(,Haemophilus influenzac,)d,株中分离到的第,3,个限制酶。,三、限制性核酸内切酶的命名原则,1,一般性状,分子质量为,60 kD,，单链多肽，最适,pH,为,6,8,；,对热不稳定，通常是溶于含有,50,甘油的缓冲液中贮存于,20,环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。,NaCl,有抑制作用，能被,Mg,2+,激活，巯基有保护作用。,2,识别序列,它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是,4bp,6bp,，有些则为,7bp,8bp,，甚或多于,8bp,。,多数限制酶的识别序列为,回文结构,，在识别序列内或其附近水解,DNA,链中的磷酸二酯键。,四、,类限制性核酸内切酶,5,-,GAATTC,-,3,3,-,CTTAAG,-5,5,-,GTTAAC,-,3,3,-,CAATTG,-5,EcoR,的识别序列,Hae,的识别序列,3,酶切切口,有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具,平头末端,；,很多限制酶不能精确地在,2,个对称轴部位切割，而在识别序列,2,条链对应位上错位切割，切割产物有些形成,5,-,突出的粘性末端,另一些为,3,-,突出的粘性末端,。这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的,DNA,分子都能和另一个含相同识别序列的,DNA,分子容易地连接成新的重组分子。,5,NNNNNN,GTTAAC,NNNNN,3,3,NNNNNN,CAATTG,NNNNN,5,5,NNNNN,GTT,AAC,NNNNN,3,3,NNNNN,CAA,TTG,NNNNN,5,Hae,的识别序列和酶切切口（平端）,5,NNNNNNN,GAATTC,NNNNNNNN,3,3,NNNNNNN,CTTAAG,NNNNNNNN,5,5,NNNNN,G,3,NNNNN,CTTAA,EcoR,的识别序列和酶切切口（粘端）,AATTC,NNNNNN,3,G,NNNNNN,5,4,贮存与应用,限制酶对热不稳定，贮存于,-20,C,，为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有,50,甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。,5,限制酶的活性单位和质量评估,限制酶的活性单位,是指在适当的条件下,(,通常为,37,，,pH7.5,8.0,，,NaCl 50 mmol/L,150 mmol/L,，,Mg,2+,5 mmol,L,10mmol,L,，反应体积为,50L),，,1 h,内完全酶解,1g,特定底物,DNA(,常用者为,DNA),的酶活性。,6,影响限制酶活性的因素,1,）“星”活性,酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。,EcoR,：,GAATTC,-,EcoR,*,：,AATT,酶浓度太高,缓冲液的组成偏离,(,如用其他金属离子代替,Mg2+,、高,pH,或低盐,),有机溶剂,(,如乙醇、异丙醇、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙三醇,),，,反应液中甘油的终浓度高于,5,注意事项,尽可能使用能在相应时间内获得完全酶解的最少酶量,减少反应体系中甘油的含量,10%,除,Mg2+,外不加其他重金属离子,适当提高反应系统的离子强度,尽可能除去反应系统中可能存在的有机溶剂，如沉淀,DNA,用的乙醇,/,异丙醇。,2,）甲基化,识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。,限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的酶解活性。,受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。,所用符号为：,m,4,C,表示,C4-,甲基化胞嘧啶，,m,5,C,为,C5-,甲基胞嘧啶。,3,）底物性状,随底物的不同而活性发生改变,某些限制酶对线性,DNA,和超螺旋,DNA,底物的活性有所不同。,如,Eco,R I,、,Pst,I,和,Sal,I,酶解超螺旋,pBR322 DNA,时的用量比酶解同样量,DNA,的用量至少需要增加,5,倍量的酶。,由于限制酶活性单位一般是用,DNA,为底物确定的，因此，对非,DNA,底物进行酶解时，最好作些预实验，以寻找最适酶用量的条件。,底物位点优势,有些限制酶对同一,DNA,底物上,不同酶切位点,的切割速率也有差异，称为底物位点优势。,最常见的是,Hin,d,对,DNA,的消化产物中,4.3 kb,带的荧光亮度常比,2.3 kb,和,2.0 kb,带还浅，显示,Hin,d,对该片段位点的切割效率低于其他位点，表现出位点优势效应。,此效应于,1975,年已被发现，但其机制尚未阐明，,与不同位点上碱基的甲基化修饰有关，,可能与识别序列外的,DNA,空间结构或某种化学修饰有关。,4,）试剂：缓冲系统,必须用有足够缓冲能力的缓冲液以维持反应最终的适当,pH,。,Tris,缓冲系统,是最广泛应用和不利因素最少的，但其温度系数大，其,pH,亦可受浓度的影响，稀释时须重测,pH,；,反应,pH,大于,9,时，常选用,甘氨酸缓冲系统,；,要求,pH6.0,7.5,时，,磷酸缓冲液,是个好的缓冲系统，温度系数小，但磷酸缓冲液仅用于后续的酶促反应不受磷酸根离子抑制的系统，如磷酸盐会抑制末端标记和连接反应；通常的酚抽提和乙醇沉淀不能有效地去除磷酸根离子；能络合,Mg2+,的柠檬酸盐和其他生物缓冲试剂不宜使用。,5,）限制酶活性不良的可能原因及解决措施,酶已失活，,反应体系中有抑制剂存在，,缓冲液组成或反应温度不适，,DNA,已甲基化、未甲基化或其他修饰，,DNA,的纯度未达到，,底物中没有所选酶的识别序列，,电泳凝胶的浓度不适，等等。,7,限制片段末端的连接作用,5,NNNNNNN,GAATTC,NNNNNNNN,3,3,NNNNNNN,CTTAAG,NNNNNNNN,5,5,NNNNN,G,3,NNNNN,CTTAA,AATTC,NNNNNN,3,G,NNNNNN,5,5,NNNNN,G,3,NNNNN,CTTAA,AATTC,NNNNNN,3,G,NNNNNN,5,8,特殊性质的,限制酶,1),可变酶,其识别序列一般不止,6bp,，且识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。,如,Bst,的识别序列及切割方式为：,5,CCANNNNNTGG,3,3,GGTNNNNNACC,5,2)S,类限制酶,又称远距离裂解酶,(Distant cleavage),这类酶的识别序列为,不对称的,4 bp,7 bp,，切割位点在,识别序列外确定的,l bp,20 bp,.,切割位点在识别序列两侧以括号内的数字注明。由于其切割位点特殊性，致使其在基因工程中具有一定的应用价值。,3),双切割酶,如,Bsp,24l,的识别序列为,:,(8/13)GACNNNNNNTGG(12,7),，,序列两端括号内的数字表示切割位点在标出链的识别序列,5,-,端上游第,8,位碱基、,3,-,端下游第,13,位碱基处，以及在互补链识别序列的,5,-,端上游第,12,位碱基、,3,-,端的下游第,7,位碱基处双切割,.,4),同裂酶,(issochizmer,),亦称为异源同工酶，是从不同菌种分离到的不同的酶，但它们的识别序列相同，切割方式可以相同也可以不相同。,如,Hap,与,Msp,I,的识别与切割序列均相同,.,第二节 甲基化酶,能识别限制酶识别的序列，并把其中的某些碱基甲基化（常见,使限制酶识别序列中的,C,或,A,甲基化修饰,),，属,修饰酶类,。,经修饰的,DNA,不再被限制酶降解。,已分离到与许多,类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应,II,类限制酶名称前加一个,M,表示。,如,M,Eco,R I,是能使,Eco,R I,识别序列中,(GAATTC)3-,端的,A,甲基化,(GA,m6,ATTC),的酶,识别序列中某些碱基甲基化对,II,类限制酶的影响至少有,3,种：,敏感的，甲基化后不能再切割；,不敏感的甲基化后仍可切割；,依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。,第三节 与,DNA,合成相关酶类,核 酸,核酸水解酶类,核酸合成酶类,核酸修饰酶类,核酸内切酶,核酸外切酶,DNA,聚合酶,RNA,聚合酶,DNA,连接酶,甲基化酶,核苷酸激酶,核苷酸转移酶,磷酸酶,一、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,1,三种酶活性,1,）,DNA,聚合活性,dTTP,5,5,A T G C A A T T G C 3,|,3,T A C,G,T,5,5,引物,5,A G C T T C A G G A T,A,3,|,3 T C G A A G T C C T A T C G A C 5,?,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,能切除突变的,DNA,片段,能辨认错配的碱基对，并将其水解,G,C,2,）核酸外切酶活性,小片段,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,5,核酸外切酶活性,大片段（,Klenow,酶,）,DNA,聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,二、,Klenow,酶,1:,随机引物标记核酸探针,2:5-,粘端补平或,3,端标记,3:,合成,cDNA,的第二链,4:DNA,序列分析,5:3-,端的末端标记,三、逆转录酶,逆转录,mRNA,DNA,以单链,RNA,为模板合成双链,DNA,的反应。,1975,年，,H.Temin,RNA,病毒,:,劳斯鸡肉瘤病毒,放线菌素,D,(-),(-),DNA,合成,RNA DNA(,前病毒,)RNA,“,前病毒假说,”,逆转录酶的应用,:,应用于基因工程,基因,mRNA,蛋白质多肽链,逆转录病毒细胞内的逆转录现象：,RNA,模板,逆转录酶,DNA-,RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,双链,DNA,*,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样具有遗传物质的传代与表达功能。,AMV-,逆转录酶；,Mo-MLV-,逆转录酶,5,3,聚合酶活性（,+,）,3 5,外切酶活性（,-,）,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,cDNA,文库的组建,Taq,DNA,聚合酶是从栖热水生菌,(,Thermus aquaticus,),中分离纯化的依赖,DNA,的,DNA,聚合酶。,最适温度,7580,。,需要,Mg,2+,(10 mmol,L),，在低浓度,Mn,2+,(2 mmol/L),中有低活性，,Ca,2+,使其完全失活，一价阳离子高至,0,.,1 moI,L,对活性无影响，而最适浓度,NaCl,为,40 mmol/L,，,KCl,为,60 mmol/L,。,四、,Taq DNA,聚合酶,最适,pH7,.,8(Tris-HCl),，与大肠杆菌,DNA,聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性。,自,1976,年从,Thermus aquaticus,菌中分离纯化到此酶后，直至,1985,年,PCR,概念的形成，才将此酶应用于,PCR,技术的建立和完善。对基因的克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大的作用。,复习题,1,为什么说限制性内切酶被誉为分子生物学家的手术刀，结合第,1,、,2,章所学内容 论述其在基因工程中的意义？,2,试述大肠杆菌,DNA,聚合酶的酶学特点和应用价值。,