LC的采购验收与维护讲义.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,LC,的采购验收 与 维护,主要技术参数解读,安装验收,3Q,认证,液相色谱泵,泵型：二元、四元泵压力：,0-*psi,（,1Bar=14.5037psi,）,流量：,0.01-10ml/min,以,0.01ml/min,递增精度：,0.075%RSD,流速准确度：,1.0%,滞后体积：,650L,，,不随反压变化梯度准确度：,0.5%,不随反压变化梯度曲线：线性、步进、凸线和凹线等,11,种,脱气方式：在线真空脱气,一、主要技术参数,并联泵和串联泵并联泵：二元泵串联泵：四元泵,梯度混合方式,(,由泵决定,),二元泵和四元泵的区别,二元有两个泵，,泵后混合，气体的溶解度随压力的增大而增大，所以二元高压混合不会产生气泡。,四元只一个泵（另外一个是辅泵），,是泵前混合，在常压下进行的，两种液体混合时，会降低气体在混合溶液中的溶解度，通常会有气泡产生，所以四元低压梯度系统一定要配在线真空脱气机。,二元泵和四元泵的配置,二元高压梯度：,配置：双泵,+,在线混合器,工作方式：双泵并联，可同时有两个流动相，按照预先设定的配比进入，再高压下进行混合，混合配比更准确，不易产生气泡，不用为了转换流动相而反复清洗，提高了工作效率。同时可以做梯度洗脱，当待测样品成分复杂，用一个固定的流动相配比无法将样品中成分完全分开时，就需要用到梯度洗脱，在同一个分析过程中由仪器自动改变流动相配比，将样品中前次无法分离的物质进行洗脱，在同一谱图中得到分开的峰的效果。有助于提高分析准确性，避免遗漏重要物质的检测。,四元低压梯度：,配置：单泵,+,低压梯度阀在线脱气机,+,混合器,工作方式：最多可同时有四个流动相进入流路，按照预先设定的配比进行混合，由于在常压下混合所以较易产生气泡，因此必须配备在线脱气机，可消除气泡影响。可以做梯度洗脱，在仪器上进行设定之后，在同一样品分析工程中，相隔一段时间后，按照用户设定的配比自行改变流动相配比，将样品中所有组分分离开来，有助于提高分析准确性。,二元泵和四元泵的梯度精度,二元高压梯度流量控制精度更高，混合室在泵后，高压下混合效率也高很多、梯度组成精确；四元低压梯度系统采用单泵加梯度比例阀来实现，因为比例阀是在泵前的，并且各流路的溶剂在比例阀里就混合在一起了，所以是泵前、低压混合。一般地，对于常规分析来说，四元低压梯度也可以满足需要；如果分析样品成份复杂、对重现性要求较高，或者需要在低流量下进行梯度分析，还是选择高压梯度好一些。,滞后体积：,650L,，,不随反压变化,1.,滞后体积变化的影响,设计不好的,HPLC,系统，滞后体积随反压变化,滞后体积随反压变化的后果,方法的适应性不好,梯度的重现性不好,液相色谱泵,液相色谱泵,2.,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟,例如滞后体积为,2.0ml,，,流速,1.0ml/min,实际梯度会比设置值晚,2,分钟响应,对微柱色谱影响更大，,如上例流速,0.1ml/min,，,实际梯度会比设置值晚,20,分钟响应,滞后体积的不同会使方法转换麻烦,如,滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现,普通,HPLC,的滞后体积,对分析型,HPLC,没有影响,对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小,的液相色谱仪，以适应梯度实验,梯度曲线：线性、步进、凸线和凹线等,11,种,液相色谱泵,数字越小，一开始比例变化大，数字越大，最后比例变化大,1,、吹氦脱气法,：,使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在,0.1Mpa,压力下，以约,60ml/min,流速通入流动相,10-15min,以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；,2,、抽真空脱气法：,此时可使用微型真空泵，降压至,0.05,0.07Mpa,即可除区溶解的气体。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。,3,、超声波脱气法：,它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气,10-20min,即可。,该方法操作简便，基本能满足日常分析的要求。,4,、在线真空脱气法：,把真空脱气装置串联到储液系中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。,常用的几种脱气方式,泵的维护一、问题：主要表现为压力不正常,1.,气泡,2.,单向阀,3.,堵塞,二、基本维护,防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒，常用的方法是滤膜滤过。,流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂。,泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。,输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。,流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。,漂移、噪声、灵敏度,检测,器,1.,紫外检测器：,有单波长、多波长、波长全扫描（二极管阵列）（,注意氘灯使用时间,）,2.,示差折光检测器,对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能够检测。在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其对聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定。另外在制备色谱中也经常用到。还适用于流动相紫外吸收本底大，不适于紫外吸收检测的体系。,3.,荧光检测器,灵敏度在目前常用的,HPLC,检测器中最高，在,HPLC,中应用较多。仅次于紫外吸收检测器。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生剂后，可以检测很微量的氨基酸和肽。,4.,蒸发光散射检测器,可以检测没有紫外吸收的大分子有机物质，如人参皂苷、黄芪甲苷等，还可以测糖（可以走梯度，示差检测器不行）。,4,种主要的检测,器,与检测器有关的故障及其排除,1,）流动池内有气泡,如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰”，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要,注意不使压力增加太多，以免流动池破裂,。,2,）流动池被污染,无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用,1mol/L,硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。,3,）光源灯出现故障,紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。,4,）倒峰,倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。,以美国,Rheodyne,公司的,7725,和,7725i,型最常见，其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。进样量准确，重复性好（,0.5%,），操作方便。,六通阀进样器,进样量的设定范围,:1-100L,样品数：,100,位,进样量重现性,RSD,：,0.3%,交叉污染：,0.005%,自动进样器,1.,使用效率,2.,维护,自动进样器价格昂贵，结构复杂，维护要求高，维修成本高。手动进样器的人为因素较多，定量误差和重复性要差一些,(,部分进样法,);,价格相对便宜，易于维护和修理。,3.,精确度,完全进样且操作正确的情况下，定量环进样更精确。,2,种进样器的比较,设定温度范围：室温,-100(1,步进）温度控制精度：,0.1,（,色谱柱切换功能）,柱温箱,工作站,耗材配件：,色谱柱、流动相瓶、样品瓶,(,包括瓶盖垫、内叉管,),、,在线过滤器的滤芯、保护柱及柱芯，流动相金属过滤头、,PEEK,管和接头、过滤装置、超声波,1.,流量准确度：,设置流量为,1.0mL/min,，,用一个干燥的,10mL,容量瓶（称重好的）接留出液，一接开始记时，准确装满,10mL,停止。再去称量，得到水的重量。水的重量除时间即是流量准确度。,2.,流量精度：,照流量准确度连续测定几次计算,RSD,。,3.,检测器基线噪声：,停留流动相一个小时，选择响应最大的峰为结果,二、安装验收,噪声的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。噪音过大将导致基线不稳，进而影响分析结果。,动态噪音：,整个流路单元及检测单元都在工作时的噪声，能够最直接的反映仪器系统的噪声大小。,静态噪声：,由仪器的光学部件与电子部件所产生的噪声，仅仅说明了检测单元的噪声大小，并没有涉及到流路单元，而流路单元却恰恰是系统噪声的主要来源，在仪器的使用过程中是不可避免的。有些公司，包括一些进口品牌生产商在对外宣传时片面地强调空池噪声，而闭口不谈动态噪声，这是不科学的。我们在检测样品的时候哪有不需要输液单元的呢？动态噪声才是仪器所必需注重的指标，也是影响用户分析的重要因素,检测器基线噪声,4.,检测器基线漂移：,停留流动相一个小时，从开始到结束看上下漂移最大的为结果,5.,重现性：,做整台仪器的重现性，用甲醇做流动相，工程师带的色谱柱、标准品，反复进样几次测试峰面积的,RSD,6.,进样量准确度,：分别进,20,、,40,、,60,、,80,、,100uL,看线性,(,进样量重现性,RSD,：,0.3%,),7.,交叉污染：,进一个标准品后在进个空白看污染情况,8.,梯度精度：,A,溶剂为纯水，,B,溶剂为,0.1%,丙酮的水溶液，每隔,5,分钟将,B,流路比例增加,10%,，从,0,变到,100%,（不接柱子）,取,C,18,色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0,ml/min，,检测器波长设定为254,nm,开机预热，待仪器稳定后取1,10,-7,g/ml,的萘/甲醇溶液进样20,l，,记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声峰峰高计算最小检测浓度,C,L,。,公式如下：,C,L,=(2,N,d,C)/H,式中,C,L,最小检测浓度，,g/ml；,N,d,基线噪声峰峰高，,mm；,C,标准溶液浓度，,g/ml；,H,标准溶液峰峰高，,mm。,在静态条件下，用注射器注入,9.,检测器最小检测浓度的测定：,什么是,3Q,1.IQ,Installation Qualification,安装验证,2.OQ,Operational Qualification,操作验证,3.PQ,Performance Qualification,性能验证,Design and development Qualification,设计与开发验证,三、,3Q,认证,严格说来，药品在制造生产的过程当中均需透过层层严密的确认，来证实药品的安全性及其品质确实有效、可靠，而欲达到这样的目的，就必须对各种生产有关的事项，作一连串符合科学性的评鉴，包括各种仪器、分析方法、支援系统与制造过程的验证等，而我们将这些过程统称为确效（,Validation),。,换句话说确效是对产品的各项相关事项作出科学性的评价及书面记录的过程，因此仪器的验证只是确效作业中的一个环节。,3Q,有什么作用,1.,简单的说，就是确认你的仪器使用是否符合标准,2.,根据欧盟和美国,FDA,要求做的验证,3.,验证可以自己做，也可以是供应商做,4.,验证后有验证文件,仪器为什么要,3Q,认证,谢 谢！,