第7章吸光光度法621.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,上一页,下一页,返回,退出,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,上一页,返回,退出,下一页,返回,退出,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基本内容和重点要求,掌握物质对光的选择性吸收、吸光度和透光度、朗伯,比耳定律及摩尔吸光系数等知识；,了解分光光度法的特点、基本原理、仪器构造和各部件的作用；,学习显色反应和显色条件的选择；,理解分光光度法定量分析中的各种影响因素。,返回,7-1 紫外-可见吸光光度法概论,一、方法依据及分类,二、方法特点,三、光的基本性质,四、物质对光的选择性吸收,返回,一、方法依据及特点,基于,物质对紫外,-,可见光的选择性吸收,而建立起来的分析方法,(,比色法、,可见分光光度法,及紫外分光光度法）。,灵敏度高、选择性好 可测,10,-3,-10,-6,mol,L,-1,准确度较高 相对误差为,2%5%,，满足微量分析要求,应用广泛 可测定大多数无机物质及具有共轭双键的有机 化合物。,仪器简单、操作简便、分析快速 一般不分离干扰物质就能测定,返回,二、,物质对光的选择性吸收,单色光,：,具有同一波长的光,复合光,：,不同波长组成的光,可见光的波长大约在,400,760nm,之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一定的波长范围。,返回,互补色光,如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为,互补色光，两种颜色互为补色,。,返回,物质颜色和吸收颜色的关系,白光,KMnO,4,紫色,返回,吸收黄绿色光,白光,CuSO,4,蓝色,吸收黄色光,表,7-1 物质颜色和吸收光颜色的关系,物质颜色,吸收光,颜色,波长范围,/nm,黄绿,紫,400450,黄,蓝,450480,橙,绿蓝,480490,红,蓝绿,490500,紫红,绿,500560,紫,黄绿,560580,蓝,黄,580600,绿蓝,橙,600650,蓝绿,红,650750,返回,光吸收曲线（可用实验方法确定）,400 450 500 550 600 650,/nm,A,0.8,0.6,0.4,0.2,最大吸收波长,max,返回,定性分析依据,：,不同物质具有不同吸收曲线形状和,最大吸收波长,（,max,处灵敏度最高）,它描述了物质对不同光的吸收能力,400 450 500 550 600 650,/nm,A,0.8,0.6,0.4,0.2,max,返回,定量分析,：,max,处,吸光度大小,不同浓度的同一物质，,max不变，在吸收峰附近处的A随浓度增加而增大,7-2 光的吸收定律,朗伯比耳定律,透光率与吸光度,朗伯比耳定律,吸光系数、摩尔吸光系数,吸光度的加合性,返回,1.,透光度,T与吸光度A,I,0,I,r,I,a,I,t,透光度或透射比,吸光度,Transmittance and Absorptivity,返回,平行单色光,均匀,2.朗伯比耳定律,Lambert-Beers Law,朗伯定律,A=lg,=,k,b,(,c,一定时）,比尔定律,A=lg,=,k,c,(b,一定时）,A,吸光度,K,比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长、温度等有关,b,液层厚度，,cm,c,溶液的浓度，,mol,L,-1,或,g,L,-1,返回,I,0,I,I,0,I,合并,吸光系数、摩尔吸光系数,吸光系数,a,：,摩尔吸光系数,：,是吸光物质的吸光能力的量度,(,大灵敏度高,),关系：,M a,c,g,L,-1,b,cm,a,=,A,/(,b c,)，,Lg,-1,cm,-1,c,mol,L,1,b,cm,=A/(b c)，Lmol,-1,cm,-1,返回,朗伯,比耳定律,适用条件,有色稀溶液、均匀,非散射的吸光物质,(,气体和固体,),入射光为垂直照射的平行单色光,吸光物质间无相互作用,被测物质不存在荧光或光化学现象,3.,吸光度的加合性,多组分体系中,(各吸光物质无相互作用),返回,7-3 偏离朗伯比耳定律的原因,标准曲线（校正曲线）,非单色光引起的偏离,化学因素引起的偏离,介质不均匀引起的偏离,返回,Standard curve，calibrated curve，working curve,1.,标准曲线（校正曲线,）,A,0.50,0.40,0.30,0.20,0.10,0 2.0 4.0 6.0 8.0 10,m,g/mL,返回,A,x,（,相同条件下测定,）,C,x,固定b、I,0,和,A,0.50,0.40,0.30,0.20,0.10,0 2.0 4.0 6.0 8.0 10,m,g/mL,正偏离,负偏离,返回,2.,偏离比尔定律的原因,（,1）比尔定律的局限性,此定律只适用于,稀,溶液（假设吸收离子之间无相互作用）。,高浓度时，粒子间的距离缩小，相互作用力增大，改变粒子对光的吸收能力，使,A,与,C,之间的线性关系发生偏离。,（,2）,非单色光引起的偏离,目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光，物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比耳定律的偏离（仪器条件限制）。,克服非单色光引起的偏离的措施,：,使用比较好的单色器；,入射光波长选择在被测物质的最大吸收处（灵敏度最高，线性关系最好）；,测定时应选择适当的浓度范围,。,返回,（,3）,化学因素引起的偏离,溶液中的吸光物质常因,解离,、,络合,、,缔合,、,形成新化合物,或,互变异构,等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯,比耳定律。,在分析测定中，要,控制溶液的条件,，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比耳定律的偏离。,返回,Cr,2,O,7,2-,+H,2,O,2HCrO,4,2-,2CrO,4,2-,+H,+,橙色,黄色,Cr的总浓度相,同时，A 取决于,C,(Cr,2,O,7,2-,)/,C,(CrO,4,2-,),之比值,加酸或加碱，使,C与,A,之间符合,L-B定律,max,=375nm,max,=350nm,4.,介质不均匀引起的偏离,溶液不均匀时，入射光通过溶液后，有一部分因,散射,现象而损失，使透射比减少，实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲（正偏离）。,在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊,。,返回,分光光度计及其基本部件,一、,基本部件及性能,光源,单色器,吸收池,检测系统,读数指示器,返回,1.光 源,在,可见光和近红外光区，常用,钨灯或碘钨灯,作光源，它们辐射,3601100nm波长的光（,要求：光源发出所需波长范围内的连续光谱具有足够的光强度，并稳定,）；,在近紫外区，常使用氢灯或氘灯，它们能辐射,180375nm波长的光。,光源,单色器,检测系统,吸收池,返回,2.单色器,由,色散元件,（将光源发出的连续光谱分解为单色光的元件）、,入射狭缝,、,出射狭缝,和,准射镜,组成。,常用的色散元件,：,棱镜或光栅,。,棱镜：用,光学玻璃或石英,制成，光通过棱镜发生折射而色散，按波长顺序将复合光分解为单色光。,光栅,光通过,光栅,发生衍射和干涉现象,而分光,。,优点：波长范围宽、色散均匀、分辨率高,缺点：各级光谱重叠相互干扰，可用适当滤光片消除,返回,3.吸收池,也称比色皿，用于盛吸收溶液的液槽；,由无色透明的光学玻璃或石英制成,；,液层厚度为0.5、1、2、3cm等的一套长方形或圆柱形比色皿。注意放置位置及光洁,光源,单色器,检测系统,吸收池,返回,4.检测系统,是一种光电转换元件，将光能转换为电流进行测量。,常用的光电转换器：硒光电池,或,光电管,硒光电池：当光照射时，硒电池表面就有电子逸出，能产生10100,A的光电流，对光的敏感波长范围300800nm。,特点：结构简单，便宜，更换方便，长时间使用会出现疲劳现象(,照射光强度不变而产生的光电流逐渐下降,）。,返回,光电管,：由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空 二极管。,由于阴极材料光敏性能不同，分为红敏（使用波长为,6251000nm,）和蓝敏（波长范围,200625nm,）；光强相同时所产生的电流约为光电池的,1/4。,特点：易放大、灵敏度高、光敏范围广、不易疲劳。,常见的分光光度计,紫外分光光度计,7-5,显色反应及显色条件的选择,一、,显色反应,的要求,二、显色反应的选择,三、显色条件的选择,四、显色剂,返回,一、,显色反应（,Color reaction）的要求,显色反应：待测物质本身,有较深的颜色，直接测定,；待测物质是,无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，,此反应称为,显色反应,，所用的试剂称为,显色剂,（,color reagent,）。,按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和配位反应两大类，而,配位反应是最主要的,。,返回,显色反应的要求,灵敏度高,，有色物质的,应大于,10,4,；,选择性好,，干扰少，或干扰容易消除；,有色化合物的,组成恒定，化学性质稳定,，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定；,显色剂在测定波长处无明显吸收,，即显色剂对光的吸收与配合物的吸收有明显区别，要求两者的最大吸收峰波长之差,（称为对比度）大于,60 nm,。,返回,二、,显色条件的选择,显色剂用量,酸度,显色温度,显色时间,干扰的消除,溶剂,返回,1.,显色剂的用量,M +,R,=,MR,（被测组分）,（显色剂）,（,有色配合物）,为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。如：,Mo(SCN),3,2+,Mo(SCN),5,Mo(SCN),6,-,在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。,返回,SCN,-,浓度过低,SCN,-,浓度过高,红色,浅红色,浅红色,c,A,0,c,A,0,c,A,0,1,2,3,返回,C,为显色剂的浓度,Ca,C,a,C,b,Cb,2.酸 度,R +H,+,HR,影响显色剂的平衡浓度（影响显色反应）和颜色,影响被测金属离子的存在状态(酸度低时易水解）,影响配合物的组成,如：,Fe,3+,+ssal,制作,pH与吸光度关系,曲线确定pH范围。,pH,A,0,返回,pH=23,Fe(ssal)红紫色,pH=47,Fe(ssal),2,棕橙色,pH=810,Fe(ssal),3,黄色,3.,显色温度,显色反应大多在室温下进行，有些显色反应需加热至一定温度完成；如：,磷钼蓝法测磷，发色温度为,5560,。,有些有色物质温度偏高时易分解；,适当温度选择：制作温度与吸光,度关系曲线确定稳定显色温度范围,。,返回,t/,A,0,4.显色时间,有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳,定状态，并在较长时间内保持不变；,有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色；,有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定；,适当时间选择：制作吸光度,-,时间曲线确定适宜时间。,返回,t,A,0,t,A,0,t,A,0,1,2,3,返回,t,1,t,2,t,1,t,2,5.干扰物质的影响及消除,干扰物质的影响：,干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在 测量条件下也有吸收，造成正干扰；,干扰物质与被测组分反应，使显色反应不完全，也会造成干扰；,干扰物质在测量条件下从溶液中析出，使溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度,。,返回,干扰的消除,加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子形成无色络合物或无色离子（如测Co,2+,时，Fe,3+,有干扰，加入NaF消除）；,选择适当的显色条件以避免干扰（控制pH值，如用ssal测Fe,3,时，Cu,2+,有干扰，控制pH=2.5时消除其干扰)；,选择适当的光度测量条件(如,max,等）,；,分离干扰离子（采用沉淀法、离子交换法、溶剂萃取法等）。,返回,6.溶 剂,有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在,Fe(SCN),3,的溶液中加入丙酮颜色加深；,还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。,返回,四、,显色剂,无机显色剂,有机显色剂,返回,1.无机显色剂,无机显色剂不多，因为生成的配合物不稳定，灵敏度和选择性也不高，目前应用不多。,如用,KSCN,显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒等。,返回,2.有机显色剂,有机显色剂分子中含有生色团和助色团。,生色团,（,chromophoric group,）：,含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的,电子被激发时需能量较小，可吸收波长,200nm,以上的光而显色。,助色团,（,auxochromic group,）：,含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。助色团与生色团的不饱和键作用，使颜色加深。,返回,常用有机显色剂,磺基水杨酸：,OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe,3+,。,丁二酮肟：,NN型螯合剂，用于测定Ni,2+,。,1,10-邻二氮菲：,NN型螯合剂，测微量Fe,2+,。,返回,7-6 吸光度测量条件的选择,一、入射光波长的选择,二、参比溶液的选择,三、吸光度读数范围的选择,返回,一、入射光波长的选择,“,最大吸收原则”（,maximum absorption）,不仅,灵敏度高,，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯,-比耳定律的偏离。,“,吸收最大,、,干扰最小,”,在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时选择非最大吸收处的波长，以消除干扰。,返回,A,/nm,0,1,2,A,/nm,0,1,2,返回,二、参比溶液的选择,参比溶液的作用：,调节仪器零点，消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰。,返回,参比溶液的选择,蒸馏水,/,纯溶剂,：试液中其它组分及显色剂 均无吸收。,不加显色剂的被测试液,：显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子。,不加试样溶液的试剂空白,：显色剂有颜色。,当干扰物与显色剂也发生反应时，,加适当掩蔽剂掩蔽被测组分,，使之不再与显色剂作用，然后加入显色剂,作为参比溶液。,三、,吸光度读数范围的选择,从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在,0.20.8,范围内。,可通过控制溶液的浓度（如改变试样的取样量或改变显色体系的体积）或选择不同厚度的吸收池来达到目的。,返回,7-7 吸光光度法的应用示例,返回,用于常量组分和多组分的测定，在生物学中用于生物成分的鉴定和结构的研究。如蛋白质、氨基酸的测定，酶的结构、作用机理及活性的测定。,pH=5显色，,max,508nm，1.110,4,Lmol,-1,cm,-1,返回,采用标准曲线法如：,铁的测定,一、,单组分的测定,硅钼蓝法测定微量,SiO,2,pH 0.52显色，提高温度可加快硅钼黄形成（室温,下需10min完成，沸水浴中30秒即可），,max,810nm，,通常在620660nm测定。PO,4,3-,、,AsO,4,3-,有干扰（,F,-,）,返回,钛的测定（,H,2,O,2,法）,H,2,SO,4,介质显色，,max,410nm，720Lmol,-1,cm,-1,干扰：,Fe,3+,H,3,PO,4,V、W、Mo、U有干扰，但一般样品中不存在。,返回,例,1.,符合朗白比尔定律的有色溶液稀释时，其最大吸收峰的波长位置：,A向长波方向移动；B向短波方向移动；,C,不移动，但高峰值降低,；,D不移动，但 高峰值增大。,例2.在吸光光度法分析中，在选定的波长下，用1cm的比色皿测得某一浓度溶液的吸光度为A，若改用2cm的比色皿对该溶液进行测定，其吸光度为：,A不变；B1/2A；,C,2A,；,DA,2,。,例3.,某符合朗白比尔定律的有色溶液，当其浓度为C时，其吸光度为A；若其浓度增大1倍，则其溶液的吸光度为：,A不变；B A/2；,C.,2A,；D.A,2,例4.用吸光光度法测定溶液浓度较高时，偏离朗伯比尔定律的原因是什么？,答：（1）比尔定律的局限性；,（2）由于非单色光引起偏离；,（3）化学和物理因素引起。,例5.在吸光光度法中，吸光度A与透光率T的关系式为：,A.T=2-lgA;B.T=-lgA;,C.,A=-lgT,;D.A=lgT,例6：,有一浓度为 2.0,10,4,moL/L金属离子溶液，若比色皿光径长度b,1,3.0cm，测得吸光度A,1,0.120，将其稀释一倍后改用b,2,=5.0cm的比色皿测定，所得吸光度A,2,=0.200。问此时是否符合L-B定律？,解：求两种情况下的摩尔吸光系数；,当 c,1,2.0,10,4,moL/L，b,1,3.0cm，,A,1,=0.120,稀释一倍后,，,在一个显色体系内，若符合L-B定律，,应当相等，而本例中,1,和,2,不相等，故不符合L-B定律,本章小结,吸光光度法基本原理,光度计的基本部件,显色反应及显色条件的选择,吸光度测量条件的选择,吸光光度法的应用示例,返回,1,、字体安装与设置,如果您对PPT模板中的字体风格不满意，可进行批量替换，一次性更改各页面字体。,在,“,开始”,选,项卡,中,，点击“,替,换”按,钮右,侧箭,头,，,选,择“,替,换,字,体,”。（如下,图）,在图“替换”下拉列表中选择要更改字体。（如下图）,在“替换为”下拉列表中选择替换字体。,点击“替换”按钮，完成。,64,2,、替换模板中的图片,模板中的图片展示页面，您可以根据需要替换这些图片，下面介绍两种替换方法。,方法一：更改图片,选中模版中的图,片,（,有些图片与其他,对象,进行了组合，,选,择,时,一定要选中图,片 本身，而不是组合）。,单击鼠标右键，选择“更改图片”，选择要替换的图片。（如下图）,注意：,为防止替换图片发生变形，请使用与原图长宽比例相同的图片。,64,赠送精美图标,