Illumina平台测序原理和常见测序文库构建.ppt

,*,*,Illumina平台测序原理和常见测序文库构建,目录,第一部分：测序测序原理与流程 简介,文库构建,(6 hrs),cBot HiSeq2500 MiSeq,HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx,MiSeq,HCS/RTA ICS MSR,CASAVA,BaseSpace,1-8 samples,1-8 samples,DNA,Illumina,测序流程,文库构建,(6 hrs),cBot,HiSeq2500,1-8 samples,MiSeq,HiSeq2000 HiSeq2500,1-8 samples,GA IIx,MiSeq,HCS/RTA ICS MSR,CASAVA,BaseSpace,DNA,文库构建流程,片段化,DNA,末端补平,3,加,A,接头连接,PCR,高质量,DNA,文库结构,文库构建的目的是在目的,DNA,片段两端都连接上想要 的接头,此单链部分与,FlowCell,表面上,P7,接,头相同,此单链部分与,FlowCell,表面上,P5,接,头相同,Index Sequencing Primer,文库构建,(6 hrs),cBot HiSeq2500 MiSeq,1-8 samples,HiSeq2000,HiSeq2500,1-8 samples,GA IIx,MiSeq,HCS/RTA ICS MSR,CASAVA,BaseSpace,测序芯片,(Flow Cell),简介,flow cell,是有,2,个或,8,个泳道,(Lane),的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当,每个泳道,(Lane),内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸,(oligos,P7,和,P5,接头,),在,flow cell,上进行,cluster,簇生成,仪器简介,单条,DNA,模板,约,1000,条,DNA,模板的 拷贝,cBot,HiSeq Sequen,n,c,c,e,e,r,r,35,个循环的桥式,PCR,cBot 工作流程,DNA,文库变性：使用,NaOH,将双链,DNA,文库变性为单链,模板链杂交：将单链,DNA,模板杂交到,Flow Cell,上 第一链合成：以,Flow Cell,表面上的,oligos,为引物，,合成第一链,桥式,PCR,：,冲走单链,DNA,模板，以合成的第一链 为模板进行,35,循环的桥式,PCR,线性化：,将与,P5,接头连接的,DNA,链从,Flow Cell,上去除,阻断,3OH,：,防止在后续测序过程中继续延伸,DNA,链,杂交测序引物,DNA,模板杂交和一链合成,接头序列,5-3,延伸,含有,P7,和,P5,两种接头 的,FlowCell,表面,单链,DNA,分子与,FlowCell,表面的对应接头杂交,以杂交的单链,DNA,为模板，,FlowCell,上的接头为引物，合成第一链,新合成的链,原始模板链,双链,DNA,变性,丢弃原始模板链,模板链被冲洗走,新合成的链留在,FlowCell,上,桥式,PCR,扩增,单链,DNA,与,FlowCell,表面对应接头杂 交，形成,“,桥,”,以接头为引物进行扩增,桥式,PCR,扩增,变性,变性双链的,“,桥,”,得到与,FlowCell,相连的两条互补 的单链,DNA,分子,第二轮桥式,PCR,扩增,完成桥式,PCR,扩增,完成,28,循环的桥式,PCR,线性化,双链,“,桥,”,变性为单链,红色箭头为,P5,接头上的 切割位点,线性化,切割并冲走与,P5,接头相连的那 条,DNA,链,阻断,阻断,3 OH,杂交,Read 1,引物,Read1,测序引 物,将测序引物杂交到文库的接头上,Illumina,测序流程,HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx,MiSeq,HCS/RTA,ICS MSR,CASAVA,BaseSpace,文库构建,(6 hrs),cBot HiSeq2500,1-8 samples,MiSeq,1-8 samples,进行,Read1,测序,杂交,Index,测序引物，进行,Index,测序,Paired End Turnround,，合成,Read1,互补链 杂交,Read 2,测序引物，进行,Read 2,测序,HiSeq SBS 测序流程,HiSeq SBS 测序流程,1,2,3,Paired End Turnaround,Sequencing By Synthesis,，,SBS,测序原理,4,种,Fl-NTPs+,聚合酶,拍照，收集信号,去阻断，切除荧光基团,X 36-151,可逆终止化学反应,一次加入,4,种修饰的,dNTP(,可逆终止子,),准确度高,可以得到同聚物序列,合,成,照相，收集信,号,去阻断，切除荧 光基,团,下一个碱基合成,1,00 Microns,Clusters,已完成测序合成的片段,Blocked 3-ends,变性掉已完成测序合成的 片段,恢复被阻断的,3 OH,Paired End Turnround,形成的 桥,5-3,延伸,桥式,PCR,5-3,延伸,Paired End Turnround,形成的双 链的桥,Paired End Turnround,模板链,Paired End Turnround,等温变性，完成,15,轮桥式,PCR,后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链,新合成的 链,3-OH,阻,断,Read2,测序引 物,Paired End Turnround,线性化，,3-OH,阻断,杂交,Read2,测序引物,Sequencing By Synthesis 2nd Read,X 36-151,4,种,Fl-NTPs+,聚 合酶,拍照，收集信号,去阻断，切除荧光基团,Illumina,测序流程,HCS/RTA ICS MSR,CASAVA,BaseSpace,文库构建,(6 hrs),cBot HiSeq2500,1-8 samples,MiSeq,HiSeq2000 HiSeq2500,1-8 samples,GA IIx,MiSeq,第二部分：常见文库构建流程简 介,文库分类,DNA类文库,D,N,A小片段文,库,D,N,A大片段文,库,Exon,文库,PCR-Free文库,简化基因组文库、单细胞样本 文库,等,RNA类文库,转录组文库,表达谱,（RNA-Seq）,Small RNA,DNA小片段文库,DNA小片段文库,片段大小在,1Kb,以下的普通DNA文库,（200bp,350bp,500bp）,DNA小片段文库可用来进行,人重测序，动植物、微生物的de,novo,和重测序，16s,rRNA,测序，宏基因组测序,等项目类型的文库构建。,DNA小片段建库流程,DNA小片段建库流程,DNA小片段建库流程,DNA小片段建库流程,DNA大片段文库,DNA大片段文库，又名末端配对,（mate-paired）,文库,片段长度大于,1K bp,。,主要用于,动植物，微生物的de,novo,测序,DNA大片段文库建库流程,DNA大片段文库建库流程,为什么要建大片段文库,Exon文库,人类外显子组总共约,30,M,b,，占,全 部人类基因组约,1%,。,外显子具有高度的保守型，且大,部,分疾病的致病位点位于外显子区,。,外显子测序是指利用序列捕获技,术 将外显子区域DNA捕捉并富集后,进行高通量测序的基因组分析方法。,E,x,o,n,文库主要用于,人全外显子,测 序,和,目标区域测序,Exon文库流程,外显子捕获方式,液相杂,交,液相杂交是通过在溶液中，利用链碱基配对的原理，将,DNA,片段与探针杂交，然后洗脱，富集目的片段。,Exon测序特点,优点：,1,、,与全基因组测序相比，,外,显子测序具有测序覆盖度更深、数据准确性更高、花费成本,更,低等优势，对研究已知基因,的,SN,P、In,d,e,l等具有较大的优势,。,不足：,1、与全基因组测序相比，不,能 检测到基因组内较大的结构,性,变异,。,2、与转录组测序相比，不能,检 测到新的基因,。,PCR-Free文库,PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过 程中不需要进行PCR的文库。,主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高，,PCR扩增困难的样本；PCR产物。,不足：所需的样本起始量较多。,PCR-Free文库与普通文库比较,简化基因组(RAD-seq)文库,RAD-seq,即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入片 段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的变异 标记,（SNPs）,信息的技术,与传统技术相比，该类技术操作简单、不受参考基因组限 制、可简化复杂基因组；另外，基于,SNPs,的分子标记技 术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛，特别 是适合大样本量的分析。,简化基因组文库建库流程,转录组文库,真核生物,原核生物,总,RNA,利用,Oligo(dT),富 集,mRNA,去除,rRNA,随机引物六聚体反转 录合成,cDNA,末端修复，加,A,，加 接头后,PCR,扩增,Illumina,测序,将,mRNA,随机打断成,200 nt,转录组测序的研究对 象为特定细胞在某一 功能状态下所能转录 出来的所有mRNA。,应用：,转录本的种类和基因 定量,基因的转录结构,可变剪切,发现新的转录本,链特异性转录组建库,使用,ss,R,NA-seq,可以确定转录本是来自正链还是负链。以 便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并且发 现新的基因。,很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录是真核基 因的一个特征，是一种重要的调控方式。,常规转录组建库方法基,础上，在合成第二条,cDNA链时，替换dTTP 为dUTP，加上接头后降 解含dU的DNA单链。,链特异性转录组建库,均,一化,（DSN）建库,方法：,构建常规转录组文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN处 理，然后PCR再次出库。,目的：,减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。,DSN,酶,：双链特异性核酸酶,(Duplex-Specific Nuclease,DSN),，能够选 择性降解双链,DNA,和,DNA-RNA,杂交体中的,DNA,由于高丰度的基因形 成双链的速度较快，所以降解也比较多。,RNA-Seq,是用来研究某一,生,物对象在特定生,物,过程中基因表达,差,异的技术，具有,定,量准、可重复性,高,、检测范围宽、,成 本低等特点。,真核生物,原核生物,总,RNA,利用,Oligo(dT),富集,mRNA,去除,rRNA,随机引物六聚体反转录合 成,cDNA,末端修复，加,A,，加接头后,PCR,扩增,Illumina,测序,将,mRNA,随机打断成,200 nt,RNA-Seq 与常规转录组区别,RNA-Seq,转录组,应用,用于基因表达丰度 检测,用于拼接（,1G,数据量）,测序类型,SE,：,50+8,PE,：,91+8+91,建库方法,全程磁珠纯化,切胶回收,插入片段,弥散（主峰,250-330,）,单一条带,Small RNA 文库,18-30nt,范围内的RNA,结构上,5,端主要以尿嘧啶开始,与mRNA的降解、翻译抑制（基因沉默）以及形,成异染色质有关,调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物过程,包括siRNA,microRNA和piRNA,Small RNA 文库建库流程,谢谢！,欢迎一起讨论！,