干细胞简版.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1,第,11,讲,干细胞,2,本节课主要内容,1-,干细胞的定义与应用,2-,干细胞的分类及特点,3-,干细胞分离与体外培养,4-,干细胞的诱导分化,3,一 定义与应用,（一）定义,干细胞是一类具有,自我更新和分化潜能,的细胞。,具有分裂和自我复制能力,子代细胞维持干细胞原始特征,分化能力,4,（二）特征,1,、自我更新特征：,干细胞的自我更新可通过对称分裂和不对称分裂两种形式进行。,(,1),对称分裂：,一个干细胞分裂产生的两个子细胞全是干细胞。,(2),不对称分裂：,一个干细胞分裂成一个干细胞和一个短暂增殖细胞，称之为,祖细胞,祖细胞,存在于胎儿或成年组织中，是部分特化的细胞，可以分化成功能细胞。,祖细胞,分裂形成的是两个专一功能的子细胞，不具备自我复制的能力。,6,2,增殖特征,(1),增殖的缓慢性：,一般情况下，干细胞处于休眠或缓慢增殖状态。,减少基因发生突变的可能性。,(2),增殖的自稳性：,也称自我维持，维持自身数目的恒定,主要是通过不对称分裂来实现。,7,3,、分化特征,(,1),单能干细胞,（,Monopotent,stem cell),：是只能分化为单一类型细胞的干细胞。,(2),多能干细胞,（,Multipotent,stem cell,）是能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。,(3),全能干细胞（,Almighty stem cell,）是具有无限分化潜能的干细胞。,8,（三）应用：,任何涉及丧失正常细胞的疾病,都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。,组织和器官移植,疾病治疗（细胞疗法）,基因治疗,9,例,1,细胞疗法治疗心脏病,通过干细胞移植对心脏病、帕金森、糖尿病、脊椎损伤等疾病的治疗有重大价值,。,10,例,2,、,ES,细胞疗法治疗糖尿病原理示意图,11,例,3,、骨髓干细胞移植,骨髓干细胞,通过分化生成各种血细胞如,红细胞、白细胞、血小板、淋巴细胞,等。因此，骨髓对于维持机体的生命和免疫力非常重要。,骨髓移植,(Bone marrow transplantation),是各种血液肿瘤（白血病、恶性淋巴瘤）、再生不良性贫血症、重度地中海型贫血症以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病救命的根本治疗方法,。,12,例,4,、脐带血（库）,脐带血移植效果,优于骨髓,其干细胞含量更多，且较有可塑性，即使不是完全吻合，也可以移植到病患体内，而骨髓移植就需要完全吻合。,2004,年美国：儿童白血病自体脐血成功移植的全球首例。,自,1995,年起，全世界已有,40,多个国家设立脐带血血库。,在我国，山东、北京、上海、天津、广州、浙江、四川七家合法的脐血库,13,例,5,、基因治疗,干细胞是基因治疗的较理想的,靶细胞,可以自我复制更新,，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用。,通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可以,矫正缺陷基因,。,通过基因工程技术,将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中，,经过九月怀胎将会出生一个健康的婴儿。,14,二、分类与特点,从所具有的,分化功能：,单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞,。,从,来源上：,成体干细胞、胚胎干细胞,。,15,（一）胚胎干细胞,胚胎干细胞简称,ES(,E,mbryo,Stem,),细胞,是一种全能干细胞细胞系,从着床前,胚胎内细胞团,或,原始生殖细胞,经体外分化抑制培养分离获得,理论上可以分化成,任何一种组织类型的细胞,。,16,17,（二）成体干细胞,来自成体的,具有分裂和分化潜能,的细胞。,骨髓、脂肪、肌肉、脐带血、血液中均已发现具有多向分化潜能的干细胞。,血液中,每,100,万个只有一个,干细胞。,每,1,10,5,骨髓单个核细胞中有,2-5,个骨髓干细胞。,18,三干细胞分离与培养,（一）胚胎干细胞分离培养,19,1,、胚胎干细胞来源,分离自,胚胎内细胞团,-ES,细胞,早期胚胎内细胞团（,Inner cell mass,ICM,）：,主要途径,。,分离自原始生殖细胞（,Embryonic Germ cell,EGC,），,EG,细胞,。,如小鼠取,12.5,天的胎儿生殖嵴，人取,5-9,周龄的胎儿背肠系膜或者生殖嵴。,饲养层细胞上进行分化抑制培养,分离自胚胎瘤细胞（,Embryonic Carcinoma cell,）,EC,细胞：,应用方便，可与,ES,互补,20,2,、胚胎干细胞培养方法,胚胎内细胞团分离培养胚胎干细胞,培养流程,：,细胞团获得,原代培养,传代培养（建系）,鉴定（干细胞、分化潜能）,21,（,1,）有饲养层培养法,饲养层细胞：,主要,应用,小鼠胚胎原代成纤维细胞（,P,MEF,）,和,耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷,亚系,STO,细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）。,抑制细胞分裂处理。,乌苯苷是一种甾类糖苷，用作强心剂。来源于非洲的夹竹桃属植物，曾用于制作毒箭。,P,MEF,和,SIM,都,能分泌,促进,胚胎干细胞增殖和,抑制,自主分化的因子,白血病抑制因子（,Leukemia inhibitory factor,，,LIF,）。,一种天然细胞因子，因可以抑制白血病细胞系,M1,的生长和分化而得名。,22,保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态,。,添加：抑制分化因子,制备,条件培养基,在基础培养基,添加：重组的,LIF,等细胞因子,制备条件培养基。,LIF,对小鼠,ES,维持未分化状态有效，对人,ES,无效,碱性成纤维生长因子,（,Basic fibroblast growth factorb,FGF,）是一种与肝素结合的多肽类丝裂原（,mitogen,），是一重要的细胞增殖与分化调节剂。,利于保持人的胚胎干细胞的未分化状态。,（,2,）无饲养层培养法（条件培养）,23,（,3,）胚胎干细胞的鉴定,A.,碱性磷酸酶,（,Alkaline phosphatases,AKP,）活性,未分化的,ES,：丰富的碱性磷酸酶，活性很高,；,已分化的,ES,：碱性磷酸酶呈现弱阳性或阴性。,B.,端粒酶,(Telomerase),活性,胚胎干细胞有着高水平的端粒酶活性，并具有长的端粒。,24,C.,干细胞标记物,细胞表面选择性,结合和粘附,信号分子的,受体蛋白,。,特征标记物可以鉴别不同的干细胞，,+,荧光标记,+,流式细胞仪可以实现干细胞的分离。,转录因子,Oct-4,是首要的作为鉴定,全能,ES,细胞,的标志物,胚胎干细胞能表达早期胚胎细胞的阶段,特异性胚胎抗原,（,SSEA,）。,未分化的灵长类,ES,细胞,人的,EC,和,ES,细胞表达,SSEA-3,和,SSEA-4,但不表达,SSEA-1,。,未分化的小鼠,ES,细胞表达,SSEA-1,但不表达,SSEA-3,或,SSEA-4,。,25,3,、胚胎干细胞分化潜能评价,（,1,）体外分化实验,贴壁培养：观察,分化,成不同组织细胞；,不贴壁的细胞悬浮生长：观察生成,“简单类胚体”,，进一步培养生成,囊状胚体,。,（,2,）体内分化实验,注射进同源动物皮下，观察,组织瘤,生成,常规制片后观察，一般是含有,三个胚层的畸胎瘤。,（,3,）嵌合体形成,将,ES,通过聚集法或者注射法与受体胚胎结合，并且将,胚胎移植进同期化代孕母受体,，各自表达自己的基因型，最终得到,嵌合体动物。,26,（二）成体干细胞分离培养,27,指存在于一种,已经分化组织中的未分化细胞,，这种细胞能够,自我更新并且能够特化,形成组成该类型组织的细胞。,成年动物部分组织器官具有,修复和再生,能力的原因,成体干细胞在正常情况下大多处于,休眠状态,，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。,1,定义,28,2,来源,已经报道的含有干细胞的成体组织包括：脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏。,神经干细胞：,神经系统，分化成神经元、胶质细胞,造血干细胞：骨髓造血干细胞、脐带血造血干细胞,间质干细胞：骨髓、脐带血、脂肪等来源,没有证据表明成体干细胞是多能干细胞,3,成体干细胞特点,-,可塑性,成体干细胞可以突破其,“,发育限制性,”,，,跨系，甚至跨胚层分化,为其他类型组织细胞。,29,成体干细胞特点,-,可塑性,干细胞,细胞位,干细胞,标志,分化细胞,标志,分化促进,因子,神经祖细胞,神经干细胞,侧脑室室管膜细胞,巢素蛋白,CD133,微管结合蛋白,-2,神经胶质原纤维酸性蛋白,GFAP,表皮生长因子,成纤维细胞生长因子,表皮干细胞,毛囊干细胞,基底细胞,角蛋白,15,K5,、,K14,Wnt,肠干细胞,肠腺基部及近基部,K8,、,K18,、,K19,肝干细胞,Hering,管,门管区胆管周围,卵圆细胞：,OV-6,、,c-kit,、,CD34,、,AFP,小肝细胞：,间充质干细胞,骨髓窦的内腔面,SH2,、,SH3,、,CD29,、,CD44,、,CD71,、,CD99,、,CD106,、,CD124,、,CD120a,、,多种组织标志,（如骨形态发生蛋白受体,-BMPR,）,多种诱导因素,造血干细胞,骨髓、脐带血、外周血,CD34,+,、,CD38,-,、,c-kit,31,4,、成体干细胞的发现与分离,含量非常少。,成体干细胞具有特征细胞表面标志物,32,33,四、胚胎干细胞体外诱导分化与筛选,在,特定的体外培养条件和诱导剂的共同作用,下，胚胎干细胞可以分化形成其他类型的细胞。,诱导方法有：,细胞因子诱导法,特异性转录因子异位表达法。,筛选方法：,选择性标记基因筛选目的细胞法,34,细胞因子诱导法,在培养过程中,添加或者撤除,某些细胞因子可指导胚胎干细胞的增殖或者分化。,一般采用分阶段的办法,即先得到,类胚体,(Embryoid bodies,，,EBs),再在,EBs,的基础上进一步,诱导,使其分化为目的细胞。,视黄酸,（,Retinoid acid,，,RA,）、二甲亚砜（,DMSO,）是较强的分化诱导剂。,35,基因调控法,导入外源基因使,Es,细胞发生定向分化。,把在,特定发育阶段中起决定作用,的基因,首先必须确定决定细胞向不同方向分化的,关键基因,其次还要保证在适当的时候将该基因导入,ES,细胞基因组的,正确位置,上。,36,五、干细胞研究存在的问题,（一）胚胎干细胞,（,1,）,来源限制,：人类胚胎干细胞研究,（,2,）,体外培养困难,：由于胚胎干细胞在体外培养会自发分化，而且机制还不非常清楚,（,3,）,安全性：,分化方向多样性、成瘤性风险大、异体移植仍能引起免疫排斥反应。,（,4,）,伦理道德问题：,人类胚胎干细胞研究,37,（二）成体干细胞,1.,成体干细胞优点,（,1,）,来源方便,：可以从自身获得。,（,2,）,没有伦理学问题,：成体干细胞来自成熟个体，不会损伤供体。,（,3,）,避免免疫排斥反应,：,（,4,）,比较安全,：不容易导致畸胎瘤。,38,2.,成体干细胞存在的问题,（,1,）,含量极少,，分离纯化难。,（,2,）,可塑性机制,还不清楚。难以确定一种成体干细胞的确切的组织来源。,（,3,）成体干细胞在,体外增殖,而又能,维持未分化状态,的技术有待建立。,（,4,）,安全性隐忧：,成体干细胞体外长期传代后会发生表型的改变，且成体干细胞也参与肿瘤的形成。,六、诱导多能干细胞：里程碑式的科学突破,induced,pluripotent,stem,cell;iPS,cell,2006,年：由日本的两位科学家,Kazutoshi,Takahashi,和,Shinya Yamanaka,报道，把,4,个转录因子通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞,，使其变成多功能干细胞,文章发表于,CELL,杂志。,2012,年,10,月,8,日：京都大学教授山中伸弥（,Shinya Yamanaka,）与英国发育生物学家约翰,格登（,John Gurdon,）因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔生理学或医学奖。,39,科学,杂志评出,2007,年十大科技突破,40,詹姆斯,汤姆森,俞君英,山中伸弥,No.2,日美科学家成功地用,人类皮肤细胞培养出了诱导性多功能干细胞,41,（一）、诱导过程与重编程原理,来源：日本一名,36,岁女子的,脸上皮细胞,，而美国一名,新生儿的包皮,上皮细胞。,两者均采用直接重组技术，即通过，向皮肤细胞中注入,4,个特殊的基因，重编程。,日本：逆转录酶,病毒,：,Oct3/4,Sox2,c-Myc,，,Klf4,四个因子称为“典型山中因子”,美国：,慢病毒介导：,4,种,基因,（,Oct4,、,Sox2,，,Nanog,和,LIN28,）,同时加入了,7,种包括可阻碍特定蛋白质合成的物质和酶在内的化合物，以研究其各自的制造效率。其中“巴尔普罗酸”，蛋白质合成阻碍剂，导入效率从,0.01%0.05%,升至,9.6%14%,。,1.Oct3/4,Oct-4,（也称,Oct-3,）属于,POU,转录因子家族的一员,是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是全能性的标志，它能够促使,ICM,形成、维持胚胎干细胞未分化前状态并促进其增殖。,2.SOX2,基因,SOX2,基因是编码转录因子的主控基因（,master genes,）家族的一个成员。,转录因子是些与,DNA,结合并调节其他基因表达的蛋白质,3.,癌症基因,c-MYC,癌症基因,c-MYC,，是一种最容易过渡表现于人类的致癌基因,它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制,ES,细胞的分化。,4.Klf4,Krueppel,-like factor 4,，,KLF4,上皮锌指转录因子,Klf4(,旧称,GKLF),调节体外细胞的增生与分化,5,、,Nanog,蛋白,在细胞获得全能性的一系列复杂过程中发挥着非常关键的作用。,2009,Cell,：“,Nanog,”,并不是单独起作用，它更像一个“乐队指挥”，协调着一系列基因和蛋白质，让它们在各自正确的位置上发挥作用，最终为细胞带来神奇的全能性。,“发号施令”的。,46,6,、,LIN28,RNA,结合蛋白,Lin28a,Lin28b,2011,Cell:,miRNA,生物合成中的重要转录后抑制子,2013,Cell:,具备特别的愈合能力,有助于组织的修复，这将对治疗癌症有积极作用,.,产生,Lin28a,型蛋白质的老鼠，其毛发会比普通的老鼠长得更快，如果这种老鼠的耳朵被刺伤，则几乎能够完全愈合。而携带这种蛋白质的老鼠在幼年时被剪掉脚趾，则会完全长出新的来。,在斑马鱼视网膜再生过程中的作用,47,1,、利用,iPS,细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，加速对多能性调控机理的深入研究。,2,、获得的方法相对简单稳定，不涉及胚胎的破坏，无伦理道德限制。,3,、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。,4,、可望制造特定病人来源的,iPS,细胞，实现“个性化”移植来治疗诸多疾病。,（二）、应用价值与发展方向,49,（三）、存在问题,安全性：反转录病毒和,Myc,；诱导基因产生变异？引,发肿瘤,等副作用？（替代方法效率低）,细胞重组的效率可能很低。,直接,改组机制不明,新方法获得的,干细胞其功能和特性,是否与胚胎干细胞一模一样？并非。,免疫反应：实验室小鼠已观察,进展：获批人体实验,2014,年,9,月,11,日，治疗使用的,iPS,细胞由日本神户理化研究所（,RIKEN,）发育生物学中心的眼科专家高桥雅代培育而成，将用于治疗与年龄相关的视网膜退化疾病。,已经在猴子身上证明，,iPS,细胞能由受体自身的细胞生成，且不会诱发免疫反应。,50,51,进展,：新方法突破制备干细胞,自然,杂志：,2009,年,03,月,03,日,英加研究员开发出,不必使用病毒的,皮肤干细胞新技术：,配以适当的化学品和蛋白质，就能转化成脑神经元、制造胰岛素的胰腺细胞、骨或软骨、心脏肌肉，或其它多种组织。,效率很低,52,进展：新方法优化制备干细胞,2009-3-8,细胞,杂志：美科学家成功,移除诱导多功能干细胞中致癌基因,。,美国怀特黑德生物医学研究所等机构的科学家利用病毒将,“,c-Myc,”,等,4,个基因植入人类皮肤细胞，将其转化为诱导多功能干细胞。,与此同时，他 们使用一种基因编码技术，使得在基因序列中，外来基因的两端留存有特殊标志。转化完成后，他们再用一种名为,“,Cre,”,的酶识别这种标志，以此找到外来基因 并将其移除。,效率很低，且体内,Myc,基因已被激活。,里程碑式的又一进展,2012,年,8,月上海交通大学医学院冯立新研究组报道：精原干细胞可以被诱导形成卵细胞,2012,年,10,月，日本京都大学的研究人员成功地诱导小鼠皮肤细胞获得可发育的卵子，生成了健康的幼鼠。,这项工作为研究长期笼罩在神秘中的哺乳动物发育及不育症提供了一个强有力的工具。,53,万能,/,全能细胞（,totipotent,cell,，,TC,）,“刺激触发采集多功能（,Stimulus Triggered Acquisition of,Pluripotency,）”细胞，简称为,STAP,细胞,把细胞放在与红茶酸碱度近似的弱酸性溶液里浸泡,25,分钟，培养数日后就出现了新细胞。因此，这一成果一时被认为是颠覆生命科学常识的划时代重大成果。,自然,2014,年,1,月,29,日,小保方晴子：与,iPS,细胞等技术不同，这项创新技术的亮点是，,仅仅通过改变外部环境，给予细胞刺激，就能使细胞发生变化。,她认为，这项技术应该能在再生医疗和免疫研究等领域作出贡献。,2014,年,4,月,9,日，日本大阪，日本理化学研究所学术带头人小保方晴子在大阪市就“,STAP,细胞”论文问题召开记者会，强调,STAP,细胞真实存在,中国干细胞治疗乱象,55,Shanghai WA Optimum Health Care,（,臻景医疗）号称,4-8,次注射可以治疗,alzheimer,病，每次注射,3-5,万元人民币；治疗自闭症需要,2,次注射，费用,25,万元。,Tong Yuan Stem Cell,（,通源干细胞）号称治好了,1,万个病人，包括帕金森症病人。,Beijing,Puhua,International Hospital,（,北京普华国际医院）的干细胞治疗中心也提供自闭症的治疗，需要,20,万,5000,元。,56,思考题,胚胎干细胞与成体干细胞比较,什么是诱导多能干细胞？有何意义？,视频：移植细胞，而不是器官,