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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文章内容来源于网络,如果侵权或者不当的地方,请联系我删除或者改正。文章内容仅可参考,不能作为科学依据。谢谢!,The content of this article comes from the Internet.If there is any infringement or improper place,please contact me to delete or correct it.The content of the article can only be referred to,not as a scientific basis.thank you!,Chaptor 2 核酸的分离与纯化,就基因工程而言,核酸分子是其研究所涉及的主要对象,所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。,核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,核酸的分类,DNA,主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量,DNA,,,如线粒体,DNA,(,mtDNA,),,叶绿体,DNA,(,cpDNA,),,质粒,DNA,。,RNA,存在于细胞质中,如,mRNA,rRNA,tRNA,等。,除上述,DNA,,,RNA,外,还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体,其或只含,DNA,,,或只含有,RNA,。,核酸制备的一般原则,分离纯化核酸总的原则:,应保证核酸一级结构的完整性;,排除其它分子的污染。,核酸纯化应达到的要求:,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的 有机溶剂和过高浓度的金属离子;,其它生物大分子的污染应降低到最低程度;,排除其它核酸分子的污染。,核酸制备的一般原则,核酸制备时应注意的事项,:,尽量简化操作步骤,缩短提取过程。,减少化学因素对核酸的降解。,PH4-10,减少物理因素对核酸的降解。机械剪切力和高温,防止核酸的生物降解。,核酸制备的一般原则,核酸制备的步骤:,破碎细胞,提取,纯化,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂剂,降低温度,改变,pH,及盐的浓度,都利于对核酸酶活性的抑制,但均不如利用核酸酶抑制剂更有利,当然,几个条件并用更好。,对于,DNA,,,抑制,DNase,活力很容易,但防止机械张力拉断则更重要。,对于,RNA,,,因分子较小,不易被机械张力拉断,但抑制,RNase,活力较难,故在,RNA,提取中设法抑制,RNase,更重要。,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂剂,DNase,抑制,加入少量金属离子螯合剂,如,0.01E DTA mol/L,或柠檬酸钠,,DNase,基本可以全 部失活。,去垢剂、蛋白变性剂及,DNase,抑制剂,也可使,DNase,失活。,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂剂,RNase,抑制,操作要带手套。,所有器皿要严格消毒,,试剂处理,低温操作,在分离过程中要加入一定的,RNase,抑制剂。,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的去垢剂,核酸本身带负电荷,结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂,一般都是阴离子去垢剂,去垢剂的作用:,1,溶解膜蛋白及脂肪,使细胞膜破裂;,2,溶解核糖体上面的蛋白质,使其解聚,将核酸释放出来;,3,对,RNase,、,DNase,有一定的抑制作用。,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的去垢剂,SDS,脱氧胆酸钠,4-,氨基水杨酸钠,萘,-1.5-,二磺酸钠,三异丙基萘磺酸钠,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,蛋白质变性剂的作用:,1.,使蛋白质变性、沉淀,从核酸提取液中分离除去,以防造成蛋白污染。,2.,使蛋白质变性,故可使核糖体解聚释放出核酸。,3.,某些蛋白质变性剂也有抑制,RNase,活性和破裂细胞的作用。,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,苯酚,氯仿,盐酸胍,DEPC,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的酶制剂,DNase,RNase,蛋白酶,K,溶菌酶,核酸制备的一般方法和原理,核酸提取的一般过程,破碎细胞(防止核酸酶的作用),微生物:溶菌酶、,SDS,裂解。,高等植物:捣碎器破碎、液氮研磨。,酶法:蛋白酶,如胰蛋白酶,,冰冻法:反复冻融或液氮冻后组织捣碎。,动物:液氮处理后用匀浆器破碎。,细胞器,DNA,,,首先纯化细胞器。,以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,核酸制备的一般方法和原理,核酸提取的,一般过程,破碎,抽提核酸除去杂质,1,首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离,2,使核酸与蛋白质分离,3,除去脂类,4,多糖的除去,核酸制备的一般方法和原理,核酸提取的,一般过程,核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂,(,盐、有机溶剂等)杂质,最后得到均一的核酸样品。,核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是,温度,和,介质,温度:,4(5)最佳和最简单,-70是长期保存的良好温度,为一次,性保存,-20保存(冰箱的自动化霜装置),保存介质:,TE缓冲溶液,(最常用),10mmol/L Tris-Cl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,
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