乳腺癌her2检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2008/12/12,#,乳腺癌,HER2,的标准化检测,HER2,，又名,HER2/neu,，,c-erbB-2,，表皮生长因子受体（,EGFR,）家族成员；,原癌基因，位于,17q21,，编码相对分子量,185KD,的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激酶受体，表皮生长因子样分子），在细胞表面表达；,通过参与信号传道通路的一系列活动影响细胞的增殖与分化。,HER2,基因,信号传导,至细胞核,细胞核,接合部,酪氨酸激酶,活性部分,细胞浆,细胞膜,生长因子（配体）,癌基因活化,细胞分裂,HER2,受体跨膜二聚体的信号传导途径,1=,基因拷贝数,2=,mRNA,转录,3=,细胞表面受体蛋白表达,4=,细胞外受体功能域释放,A=HER2 DNA,B=HER2 mRNA,C=HER2 receptor protein,正常,扩增,/,过度表达,细胞核,细胞质,细胞膜,1,2,3,4,C,B,A,HER2,过度表达：正常状态的,10-100,倍,HER2,癌基因的致瘤机制：,抑制凋亡，促进增殖；增加肿瘤细胞的侵袭,力；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。,研究表明：,30,以上的人类肿瘤中存在,HER2,基因的扩增,/,过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜,癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等,;,20,30,的原发性浸润性乳腺癌有,HER2,基因的扩增,/,过度表达,。,HER2,阳性,患者,的生存期比阴性者缩短一半以上,转移性乳腺癌患者的中位生存期,HER2,阳性,8-10,个月,HER2,阴性,17-22,个月,Slamon DJ et al.Science 1987;235:17782,2005,年,St.Gallen,国际治疗指南乳腺癌危险度分级,低度,中度,高度,淋巴结,1,+(1,3),2,+(1,3),1,+(,3),2,pT,（,cm,）,2,伴,2,1,病理分级,1,或,2,3,1,瘤周脉管,或,+,1,HER2,或,+,1,2,+,1,年龄,35,或,35,1,2005 St Gallen,指南,乳腺癌初诊时需明确,HER2,HER2,阳性,即做为高风险因子加以考虑,Goldhirsch et al 2005,CMF,cyclophosphamide,methotrexate,5-fluorouracil,预后评估,预后差,疗效预测,从赫赛汀,的治疗中最大获益,芳香化酶抑制剂的疗效优于三苯氧胺,蒽环类和紫杉类的疗效优于,CMF,随着肿瘤的靶向性治疗的发展，以单抗为主的分子靶点药物的不断研制应用，已成为肿瘤靶向治疗的新武器,Herceptin,即为一种针对,HER2,受体的高纯度重组,DNA,衍生物的人源化单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物,刺激,刺激,HER2,細胞,増殖,刺激,刺激,HER2,癌细胞,増殖抑制,Heceptin,的作用,Heceptin,Heceptin,：,一种针对,Her-2/neu,受体的高纯度重组,DNA,衍生物的人源化单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物，具有高效、低毒、选择性强的特点,癌细胞表面存在着,CerbB-2,蛋白，,受刺激后促进癌细胞的增殖,20,30,的癌细胞,Her-2/neu,基因的蛋白,CerbB-2,与,CerbB-2,结合阻断和抑制细胞的增殖,转移性乳腺癌病人的治疗效果,检测癌细胞表面,cerbB-2,存在程度决定使用,意义,靶向药物,Heceptin,仅对,HER2,扩增的乳腺癌有效,准确的检测,HER2,有无扩增是临床应用,Heceptin,的绝,对,必要条件,，也是成功进行靶向治疗的,前题和关键,HER-2,扩增的乳腺癌往往提示其,恶性程度高，,进展迅,速，化疗缓解期短，对,CMF,方案化疗反应降低 乳,腺癌化疗药物,环磷酰胺、阿酶素、,5,氟尿嘧啶等,的主要参考指标,HER-2,扩增的乳腺癌对蒽环类药物和紫杉醇类药物化,疗敏感性高 ,HER2,和拓扑异构酶,II-a,基因同时扩,增的乳腺癌患者，可以从蒽环类药物为基础的方案,中受益，故同时检测,HER2,和拓扑异构酶,II-a,可以筛,选出以蒽环类化疗药为基础的化疗方案候选患者,HER-2,扩增的乳腺癌对三苯氧胺易产生耐药性,制,定内分泌治疗方案的有力依据,HER-2,扩增的乳腺癌无病生存率和总生存率低，并且,与淋巴结阳性、癌的高级别、阴性受体状态及高增,殖活性有关,预后判断的参考指标,意义,ST.GALLEN 2007,HER2,：,乳腺癌危险因素的新定义,低,中,高,G1,T2,ER/PR+,年龄,2,淋巴结,1-3,和,HER2+,ER/PR-,或,淋巴结,4,淋巴结,-,HER2+,ER/PR-,或,LVI,侵润 淋巴结,1-3,且,HER2 -,ER/PR+,淋巴结,-,HER2-,LVI,无,R,I,S,K,R,I,S,K,2007 NCCN,治疗指南,HER2,检测的原则,ASCO/CAP:HER2,检测指南,HER2,阳性,：,IHC HER2 3+(,完整的，强的膜阳性,30%,),或,FISH HER2,基因扩增,(,HER2,/CEP17,2.2,或,HER2,基因拷贝数,6,信号,/,核，无内对照的探针,),HER2,阴性：,IHC HER2 0-1+,或,FISH HER2,基因扩增,(,HER2,/CEP17 1.8,或,HER2,基因拷贝数,4,信号,/,核，无内对照的探针,),不能确定：,IHC HER2 2+,或,FISH HER2,基因扩增,(,HER2,/CEP17 1.8-2.2,或,HER2,基因拷贝数,4-6,信号,/,核，无内对照的探针,),HER2,测定流程图,HER2,的检测方法,免疫组织化学（,IHC,）：,HER2,蛋白的表达,荧光原位杂交（,FISH,）：,HER2,基因的扩增,显色原位杂交（,CISH,）：,HER2,基因的扩增,酶联免疫分析（,EIA,）,酶联免疫吸附分析（,ELISA,）,聚合酶链反应（,PCR,）,HER2,阳性定义,IHC 3+,CISH+,FISH+,或,或,蛋白过度表达,基因扩增,=,=,一抗结合于,Her-2,受体,二抗结合并激活底物反应显色,免疫组织化学法原理,Immunohistochemistry(IHC),IHC,检测,HER2,表达初筛最常使用的方法。,判断,HER2,蛋白过表达,最重要的是染色方法的标准化和结果的判断。,建议使用美国食品和药品管理局,(FDA),批准的试剂盒。,应使用,EnVision,法和高质量的,DAB,显色液以避免内源性生物素的影响。,应有严格的、包括内部和外部的,质量控制，须设阳性对照、阴性对照和空白对照。,IHC,结果判断,先在,10,物镜下进行判读,注意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色强度,胞质着色应忽略不计,导管内癌,(DCIS),的着色应忽略不计，,只评定浸润癌的着色情况,正常乳腺上皮不应着色,应使用,美国,FDA,批准的,HercepTest,评分系统,ASCO/CAP,：,C-erbB2 IHC,的评分,0(,阴性,):,无染色,或,10%,的细胞膜微弱的 或不完整的膜染色,2+(,弱阳性,):10%,细胞弱到中等膜染色,3+(,强阳性,):10%,中等到强的完整的膜染色,30%,0,1+,2+,3+,C-erbB2,2008/12/12,HER-2,检测,:IHC,抗原修复,有,/,无,组织固定,方法,抗体选择,评分标准,变异性,福尔马林固定,/,石蜡包埋组织,HER,基因扩增,2,5,倍（,Southern Hybridization,）,Slamon et al,Science 244:712,1989,HER2“,阴性”是由于组织固定后抗原被遮蔽,需要行抗原修复来纠正,Courtesy Michael Press,FISH,是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的,DNA,探针与细胞核内的,DNA,靶序列杂交。在荧光显微镜下，于细胞和,(,或,),组织,原位观察并分析细胞核内杂交于,DNA,靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体,(,或染色体片段,),或多种基因状态的信息。,“,金标准,”,HER2 gene,HER2 gene,HER2 gene,双链靶基因,变性的单链,DNA,与荧光标记探针复性,产生荧光信号,荧光原位杂交法原理,Fluorescence in situ Hybridisation(FISH),HER2,探针,绝大部分是同时含有,HER2,基因,(,标记为橘红色荧光,),和该基因所在的,17,号染色体着丝粒,(,标记为绿色荧光,),序列的混合探针,经美国,FDA,批准的进口探针,VS,国产探针,评价,17,号染色体数目和意义,HER2,基因位于,17,号染色体上，大约有,47%,的乳腺癌存在,17,号染色体非整体性,，,即,17,号染色体不是正常的二体，而是单体或多体。,绿色探针可以将,17,号染色体的非整体性和单纯的,HER2,基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。,当,HER2,基因与,17,号染色体数目比值大于,2,时，即为,HER2,基因扩增。,加入了这个内对照，就排除了单色探针,(,探针中仅有,HER2,基因,),可能造成的假阴性,(17,号染色体单体,),或假阳性,(17,号染色体多体,),。,临床研究显示，,具有这类遗传学特征的患者对治疗的反应和预后与单纯的基因扩增明显不同。,质量控制,内对照：杂交的组织、细胞中有,75%,的细胞核显示出双色信号,时，视为实验成功，并且红、绿信号互为对照，癌与非癌细胞互为对照。,外对照：应选择,FISH,阳性和阴性的标本片。,结果判读,杂交信号计数,应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚,(DAPI),染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的细胞。,随机计数,20,30,个癌细胞核中的双色信号。,判读标准,红色信号的总数与绿色信号的总数比值,2.2,时，即为,HER2,基因扩增,若红、绿两信号的,比值,20,或众多信号连接成簇时可不计算，即视为基因扩增；,若比值介于,1.8,2.2,之间，则需要再计数,20,个细胞核中的信号,或由另外一个分析者重新计数。如仍为临界值，则应在,FISH,检测报告中注明。,若,HER2,基因扩增在不同癌细胞中,存在异质性时，应在另一癌区域再计算,20,30,个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释。,注意避免,G2,期细胞内的基因拷贝数目特征,(4,个拷贝,),可能导致的计数误差。,HER2 probe,CEP 17 probe,HER2/CEP17 ratio=1,HER2/CEP17 ratio=1,HER2/CEP17 ratio=7,No amplification,No amplification;tetraploidy,HER2 gene amplification(ratio 2.2),HER2 FISH Patterns,FISH,Amplified,FISH,Not amplified,Aneusomy,Not amplified,Courtesy Ken Bloom,FISH:PathVysion,TM,无扩增,扩增,比值,2.2,提示,Her-2,有扩增,比值,2.2,提示,Her-2,有扩增,比值介于,1.8,2.2,临界值,Aneusomy,Not amplified,IHC,vs,FISH,C-erbB2 score,Gene amplification by FISH,0,4%,1,7%,2,10-35%,3,90%,转移性乳腺癌中：,HER2,检测,IHC 3+or,FISH+,赫赛汀,的治疗效果相当,Vogel C,et al.J Clin Oncol 2002;20:71926,26,35,34,38,48,48,Response rateClinical benefit rate,Thank You!,谢谢,!,