液相色谱基础知识（waters）.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,液相色谱基础知识,色谱柱基础知识,对HPLC柱填料的了解,平均颗粒度，颗粒度分布,颗粒度(,dp,),颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差),颗粒分布,颗粒分布越宽柱效低(渗透性差),颗粒形状,球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀,无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱填料的了解（二）,平均孔径/孔体积,孔径/孔体积分布,大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱填料的了解（三）,键合相化学,影响化合物的分离度：,a,不同键合相对不同种类的化合物分离不同,可能导致色谱的分离机理不同,如：C18、C8、CN,硅胶表面及键合相,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。,优点,固定相稳定，不易流失,应用广泛，可使用多种溶剂,消除硅羟基的不良影响,缺点,pH值不能小于3,同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,对HPLC柱填料的了解（四）,含碳量,含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）,高含碳量,有利于不易保留的化合物的分离,水解稳定性好，重现性好,有利于极性化合物的拖尾改善,低含碳量,有利于分析中性及碱性化合物,降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C%k,苊,(50/50的乙腈/水),Symmetry C181917,Zorbax ODS,1715.7,LiChrosorb,RP-181510.3,Symmetry C81212.5,Resolve C-181212.4,Ultrasphere ODS,1111.3,Partisil ODS,-31112.0,m,Bondpak,C-1810 7.9,Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱填料的了解(五),填料的端基封口,封口残余硅羟基,减少不可逆吸附或拖尾,增加碳含量（0.1%-1%）,残基处理的效果,NovaPak,C18,未封口 C18,抗坏血酸,烟酰胺,对氨基苯甲酸,哌咯西叮,核黄素,苯酚,盐酸硫胺,对HPLC柱填料的了解（六）,硅胶的活性,主要影响碱性化合物的保留行为：k,生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同,是选择性差异的主要来源,硅胶的杂质含量,重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小,是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱填料的了解（七）,填料的稳定性,硅胶填料,pH：2-8,聚合物填料,pH：2-12,pH值小于2时键合相水解,填料基质物理性质的影响,所有C18柱都是相同的吗?,填料基质的物理性质对色谱柱的影响,平均孔径及其分布影响被分析样品的分子量，大孔径的可分析高分子量样品,平均孔体积及其分布影响同孔径,含碳量影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长,填料的端基封口主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使碱性化合物拖尾,硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：K，高活性的K大,硅胶的杂质含量更苛刻条件下的碱性化合物峰形,Waters色谱柱的内径,分析柱：,Waters,Spherisorb,及其它公司品牌的色谱柱多为,4.6mm,内径。,Waters,传统品牌的分析柱以,3.9mm,内径为主，比一般分析柱,(4.6mm),细，因此：,相对灵敏度高,省溶剂，可用相对较低的流速,同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显),注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持线速度相同。,色谱柱化学及外形结构的关系,对HPLC柱的了解,理论塔板数(N),容量因子(K),选择性系数(,),其影响因素有,N：受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗,粒度越小,N越高,：,受填料表面化学性质对色谱柱的影响,不同键合相对不同种类样品分离不同,K：受键合相表面含碳量的影响,含碳量高,时保留时间长,在同样情况下保留行为也有差异,因此：,需要对色谱化学品(色谱柱)有更多的了解,需要不同品牌，即各个因素有较大差异的色谱柱，以得到更多种选择性,Waters拥有众多不同品牌的色谱柱，目的就是：供不同应用的要求,用不同品牌的色谱柱时，色谱方法有时可能需要重新开发,Waters各种硅胶基质的色谱柱,Waters不同品牌的色谱柱,m-,BondaPak,文献背景强,是工业标准,平均孔径125，10,m,m高活性、无定形硅胶,中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性,Nova-Pak,平均孔径60，4,m,m高韧度低活性球形硅胶,低酸性，高疏水性,极好的端基封口,有利于小分子物质的分析,Waters不同品牌的色谱柱,Resolve,平均孔径90，5/10,m,m低活性硅胶,非常高的疏水性,无端基封口,有利于低保留的中性及酸性化合物分离,Delta-Pak,有100和300两种孔径，5/15,m,m硅胶,中到高的疏水性，端基封口,适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry,高纯度硅胶：Fe,Al,Mg等均85%),提取板及小柱可获得一致的回收率(,RSDs,5%),容易使用,Oasis,HLB 固相提取小柱,C18与Oasis,HLB 吸附剂,浸润能力的比较,H,L,H,L,H,L,H,L,H,L,H,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,L,HLB,H=亲水单元,L=亲脂单元,C,18,特征二，通用型吸附剂,优势:,在很宽极性范围内保留酸性、碱性及中性化合物,样品不会穿透小柱,益处:,对极性化合物可获得较高回收率,使用同一方法，提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率,一种吸附剂适用于大多数SPE提取过程,Oasis,HLB固相提取小柱,结果:通用型吸附剂,0,20,40,60,80,100,Acids,Neutrals,Bases,%回收率,Ibuprofen(2.5?g),Naproxen,(2?g),Salicylic Acid(5?g),Sulfadiazine,(10?g),Sulfamerazine,(10?g),Acetaminophen(0.5?g),Theobromine,(0.5?g),Paraxanthine,(0.5?g),Theophylline,(0.5?g),Caffeine(0.5?g),Procainamide,(0.5?g),Ranitidine,(0.5?g),Oxycodone,(1?g),Propranolol,(4?g),Naltrexone,(1?g),Salbutamol,(2?g),Doxepin,(4?g),Spiked Serum on 1 cc 30 mg Oasis?HLB Cartridges,Oasis,小柱的使用方法,平衡/活化小柱,1,mL,甲醇/1,mL,水,上样,可上200,mL,样品,清洗,1mL5%甲醇/水,洗脱,1,mL,甲醇,挥发并用流动相重组,样品制备,将样品用水稀释,准备进样,Oasis,HLB,：,优化的提取方法,Oasis,HLB 固相提取小柱,特征三，重现性,Oasis HLB吸附剂填料在Waters ISO 9002-认可的工厂中生产 确保重现性.,优势,每批吸附剂进行严格的质量控制，建立SPE填料重现性的新标准,益处:,每盒产品附带合格证书,不同批次具有重现的回收率,Oasis 不同批次间重现性,Batch A,Batch B,Batch C,0.96%1.21%2.02%3.66%2.40%3.06%3.67%RS,D,0,20,40,60,80,100,%Recovery,Procainamide,Ranitidine,Acetaminophen,Propranolol,DP-phthalate,Doxepin,b,-,Methasone Valerate,Oasis,HLB-应用,各种药物提取，尤其是生理体液中的药物，,如血浆、尿液中的药物等,天然产物提取,农业化学应用，如提取除草剂、杀虫剂等,环境化学应用，如提取多环芳烃等,色谱图常见问题,色谱图常见问题主要有两类:,色谱峰峰形异常问题,例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等,色谱峰保留时间问题,保留时间不稳定等,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:,色谱图中未出峰:,进样问题:未进样或样品分解,流动相问题:泵未输液或流动相不正确,检测器设置不正确,或检测器有问题,一个或几个峰是负峰,流动相吸收本底高,进样过程中进了空气,离子对分离中的系统峰,样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题:,所有的峰均为负峰:,信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒,光学装置尚未达到平衡,所有的峰都是宽峰,系统未平衡或未达到化学平衡,溶样的溶剂比流动相强很多,色谱柱类型或尺寸不正确,色谱柱或保护柱被污染或降级,温度变化对色谱柱的影响,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题:,较早洗脱的峰呈宽峰,进样体积过大或样品浓度太高,进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适,在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞,管路问题:内径不对或切管不正确,管路连接问题:接头或锥箍不正确,检测器时间常数不正确,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题:,峰比预想的要小,样品粘度过大,进样器有问题或进样体积有误,检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确,检测器输出未置零,用了不正确的检测器输出信号,检测池被污染,检测器的灯可能有问题,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题:,双峰或肩峰,进样量或样品浓度过大,保护柱或色谱柱进口堵塞,保护柱或色谱柱污染或失效,前伸峰,进样量或样品浓度过大,溶样的溶剂相对于流动相太强,保护柱或色谱柱污染或失效,色谱图常见问题分析(一)(续),色谱峰峰形异常问题:,拖尾峰,保护柱或色谱柱问题:污染或失效,进样问题,检测器时间常数不正确,平头峰,检测器设置不正确,进样体积太大或样品浓度太高,色谱峰保留时间问题:,保留时间飘忽不定(各次运行之间),系统不稳定或未达化学平衡,泵压力不稳(泵头里有气泡),进样体积过大或样品浓度过大,温度波动,流动相混合不均匀,色谱柱被污染,色谱图常见问题分析(二),色谱峰保留时间问题:,保留时间增加或减少(各次运行之间),系统不稳定或化学平衡不足,泵流速变化,温度变化,色谱柱污染,柱效下降,流动相被污染,溶剂入口过滤器堵或管路堵塞,系统渗漏,色谱图常见问题分析(二)(续),色谱图常见问题分析(二)(续),色谱峰保留时间问题:,保留时间改变到一个新的恒定值,流动相不正确或其组成不正确,泵流速变化,实际输液的流速不正确(泵失灵或故障),环境温度变化；柱温不正确,色谱柱尺寸或类型不正确,色谱柱被污染,流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化,输液系统的梯度滞后体积不正确,HPLC常见问题,系统压力问题,压力高,压力低或没有压力,压力不稳,流路基线噪音问题,基线不稳定(不重复),长、短程振荡,基线漂移,噪音脉冲尖刺,HPLC常见问题分析,系统压力问题,压力高的原因,温度太低,流速太高,流动相粘度大,管路堵塞,仪器或色谱柱堵塞,压力传感器问题,HPLC常见问题分析(续),系统压力问题,压力低或没有压力,温度太高;流速太低,泵关闭或保险丝断了,泵未输送流动相,储液瓶中无溶剂,低压限设置不当泵未正确排气,溶剂入口过滤头堵,入口管路中有空气泵失效,系统内有渗漏处,所用溶剂不正确,自动进样器在Purge时卡住,HPLC常见问题分析(续),系统压力问题,压力不稳,压力传感器问题,泵排气不充分,泵失效,流动相未正确脱气,所用溶剂不混溶或易挥发,HPLC常见问题分析(续),流路基线噪音问题,基线不稳定(不重复),检测池中有大的气泡,流路中有小气泡流过,系统未稳定或未达到化学平衡,流动相被污染,检测器流动池漏,色谱柱污染,HPLC常见问题分析(续),流路基线噪音问题,基线漂移,系统不稳或未化学平衡,温度波动,流动相未正确脱气,流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化,检测器流动池漏;系统中有渗漏,色谱柱污染;固定相渗漏,选用不正确的检测波长(相对于溶剂),有迟流出的组分,HPLC常见问题分析(续),流路基线噪音问题,短程振荡,泵压不稳,泵入口管松,弯或堵塞,溶剂混合不充分,检测池中有大气泡,泵入口阀脏或失效,泵柱塞杆密封垫磨损,检测器出口溶液成滴状流入废液瓶,HPLC常见问题分析(续),流路基线噪音问题,长程振荡,温度波动,溶剂被循环通过系统,噪音脉冲尖刺,流路中有小气泡,泵头有气泡空腔,入口阀脏或失效,检测池中有小颗粒物,泵或检测器未正确接地,判断故障与故障排除的原则,规则一,确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复,出现，很难证实其确实存在。,规则二,一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因,素与问题之间的关联。,规则三,恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题,之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。,否则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费。,规则四,尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故,障排除经验来改善您目前的预防保养工作,使现有,问题再发率降至最低。,规则五,养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行,故障排除的关键。,