口腔微生物分子生物学1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,口腔疾病分子生物学,第一节 分子遗传学基础,一、生命的主要遗传物质-DNA,（一）对遗传物质的认识,什么是遗传物质？,蛋白质 20种氨基酸,DNA,四种碱基,转化实验的结果说明,（二）核酸的组成、分布及基本化学结构,核酸是一种高分子化合物，它的基本单体是核苷酸。,每一个核苷酸由三部分组成，一个磷分子，一个糖分子，一个碱基。,根据核苷酸的组成，核酸分为脱氧核糖核酸和核糖核酸。,DNA与RNA的区别,糖,碱基,结构,DNARNA,脱氧核糖核糖,腺嘌呤 胞嘧啶腺嘌呤 胞嘧啶,鸟嘌呤 胸腺嘧啶鸟嘌呤 尿嘧啶,双链单链,二、DNA复制,（一）,DNA,复制中的几个概念,1.,复制子（,replicon,）,DNA,复制是与细胞的分裂相联系的，主要表现在,DNA,复制的起始就意味着将要进行下一次分裂。在,DNA,完成之前，下一次细胞分裂就不会开始。,一个单独的,DNA,复制单位称为复制子。,每一个复制子都含有一个复制起点序列，又称,复制原点,，也常含有一个,末端序列,，复制的过程在此终止。,复制是在起始阶段控制的，一旦开始复制，就会继续进行下去，直到复制完成。,DNA多聚酶种类,DNA,多聚酶,是,DNA,复制的主要合成酶。,合成,DNA,还需要下列因素：,DNA,的前体材料，四种脱氧核苷三磷酸,Mg+,的存在,一小段,DNA,或,RNA,分子的,3-OH,一个,DNA,模板,DNA,多聚酶的另一个重要特征是具有,3 5,方向的内切酶功能。,（二）DNA复制的方式,1.,半保留复制,2.,半不连续复制,半保留复制,DNA复制的特点,新合成的子代,DNA,与亲代,DNA,完全一样，保证了遗传的稳定性。,半不连接复制,引导链：,5,3,方向的,DNA,合成,滞后链：3,5,方向，冈崎片段,三、基因表达,（一）,RNA,的类型,发卡环：,-AUUCGGAUAAGCCU-,种类,信使,RNA（mRNA,),核蛋白体,RNA（rRNA,),转运,RNA（tRNA,),(二)RNA的生物合成转录,转录,:,在,RNA,多聚酶作用下，以,DNA,为,模板合成,RNA,的过程。,1.,转录的模板和方向：,有意义链：模板链（,3 5DNA,链）,反义链：非模板链,2.RNA,多聚酶与启动子,启动子,：能特异性地与,RNA,多聚酶,结合，引发,RNA,合成。,从,DNA,上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束,3.,转录的起始与延伸,4.,内含子和外显子的概念,原核生物：基因是连续的,DNA,片段,真核生物：基因由若干个不连续的,DNA,片段组成的。,内含子：插入序列，它是位于基因的内部，能够被转录的一段,DNA,。但在转录后，与之相应的那部分转录产物在拼接中被去掉了。,外显子：基因中与成熟的,mRNA,相对应的,DNA,片段，它不仅包括蛋白质编码的部分，而且包括,5,和,3,末端不翻译的前导序列和尾随序列。,釉原蛋白基因表达示意图,（三）蛋白质的生物合成翻译,1.遗传密码,遗传密码的性质,所有的密码都是由三个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在,3,个终止密码子,UAA,UGA,UAG,，起始密码子：,AUG,密码子具有兼并性,通用性,2.,蛋白质的生物合成翻译,蛋白质的合成过程,.氨基酸活化,氨基酸结合至,tRNA,，即氨基酸活化，由氨酰,-tRNA,合成酶催化。,氨基酸与,tRNA,结合后，由,tRNA,根据遗传密码子将氨基酸按顺序排列合成蛋白质。,.蛋白质合成的起始,蛋白质合成在核糖体上进行，核糖体由,tRNA,和核糖体蛋白质构成。,在细菌中，蛋白质合成的第一个氨基酸是甲酰化甲硫氨酸（,fMet),。它与相应的,tRNA,结合成甲酰甲硫,tRNA,，只有它才能识别起始密码并进入核糖体的特定部位，从而启动蛋白质的合成,AUG,甲酰化甲硫氨酸（,fMet),.肽链的形成和延伸、合成的终止,终止码,UAA、UGA、UAG,蛋白质合成的终止,终止密码子,3.,新生多肽的加工,.,fMet,水解,.磷酸化、糖基化、甲基化修饰,.信号肽 蛋白质向细胞外分泌,四、基因表达,DNA RNA,蛋白质,丰富的生命现象,五、基因表达的调节,最初从一个受精卵，在个体发育过程中分化形成各种细胞组织和类型，最终形成一个完整的生物体。,机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因,共同表达的基因,维持细胞基本结构、功能,特异性表达的基因,红细胞产生血红蛋白,B,淋巴细胞产生抗体,成牙本质细胞分泌牙本质蛋白,基因表达调控的原因动力,细胞内,细胞间,或细胞与外界环境间关系的变化。,基因表达调节的方式,启动子,强启动子与,RNA,多聚酶有较强的结合能力，转录水平较高,弱启动子则反之。,基因表达调节的方式,调节蛋白的作用,负向调节,正向调节,负向调节,（一）乳糖操纵子学说,大肠杆菌的乳酸代谢由三种酶完成,-,半乳糖苷酶,半乳糖苷渗透酶,半乳糖苷乙酰化酶,操纵子（,operon,）,几个结构基因（,Z,）,调节基因,(i),操纵基因（,o,）,启动子（,p,）,（,1,）在无乳糖情况下，调节基因编码的阻遏蛋白可以和操纵基因特异性结合，使,RNA,多聚酶不能结合半乳糖苷酶基因启动子上而无法转录，结构基因就被转录。,（,2,）当作为诱导物的乳糖存在时，乳糖能与阻遏蛋白特意地结合而改变阻遏蛋白的构象，使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，因而，解除了对结构基因表达的抑制，于是,-,半乳糖苷酶、半乳糖苷渗透酶、半乳糖苷乙酰化酶等基因被转录，进而翻译。,结构基因的调控有正调控和负调控两类,没有调节蛋白时操纵子内的结构基因是开启的，而调节蛋白出现后结构基因被关闭。这样的调控称为负调控，如乳糖操纵子。,没有调节蛋白时结构基因是关闭的，而出现调节蛋白后结构基因的转录开启，称为正调控，如阿拉伯糖操纵子。,（二）,Britten-Davidson,模型,该模型主要假定基因表达得分调节是通过控制系统来调节的。,新的补充和修改,一个特定的激活蛋白可以控制含有相应接受位点的许多结构基因的表达，即可以控制一组基因的表达。,一个结构基因拥有不同的几个接受位点，每个接受位点受一个特异性的激活因子识别，这样它可以作为不同组的成员而在不同的情况下表达,基因表达的调节可以通过感应位点控制不同的集成基因而达到。,正向调节,原核生物基因表达的调节,主要在转录水平,真核基因生物调节,多层次,复杂性,第二节 分子生物学研究的主要方法,一、分子克隆的材料与方法,分子克隆：,意为“无性克隆”是,DNA,分子的无性繁殖技术。,（一）限制性内切酶,是一类能识别双链,DNA,分子中特异核苷酸序列的,DNA,水解酶。,三种限速酶,型、,型、,型,型限制性内切酶具有以下几个特征,特定的识别序列，46个碱基对,在识别序列内固定位置切割，切割后5,端磷酸基因，,3,-端羟基基团,切割后形成粘性或平齐末端,（二）DNA连接酶,催化,DNA,中相邻3,羟基和5,磷酸基团之间形成,3,，,5,磷酸二酯键。,T4 DNA,连接酶,大肠杆菌连接酶,（三）质 粒,概念,细胞内独立于染色体外的环状,DNA，,能自我复制，在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中。,特点,其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达,分子200050000,bp,T,pGEM,-T,Vector,(3003bp),Amp,r,lacZ,ori,XmnI 1994,ScaI 1875,NaeI,2695,ApaI,AatII,SphI,BstZI,NcoI,SacII,T7,SpeI,NotI,BstZI,PstI,SaLI,NdeI,SacI,BstXI,NsiI,SP6,T,1,start,14,20,26,31,37,46,55,62,62,73,75,82,94,103,112,126,pGEM-T vector map,XhoI,SmaI,XhoI,SmaI,XhoI,SmaI,pCI,pCIA-P,pGEM-T/A-P,A-P,fragment,Sub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCI,XhoI,SmaI,T,4,Ligase,A-P fragment,分子克隆中，,构建质粒的特点,Ori,区,质粒复制的起点,Par,区,保证细胞分裂过程中，质粒能均匀分配至子细胞,多克隆区,人为构建，便于克隆操作。,含有多个单一限制性内切酶酶切点。,选择因子,含特定基因，如耐抗生素基因或,-,半乳糖苷酶基因（,lacZ,），使克隆后便于挑选。,有的质粒载体在其基因组中含有一个大肠杆菌的,lacZ,区段，此区段含有编码,-,半乳糖苷酶基因,lacZ,。在诱导物,IPTG,（异丙基硫代半乳糖苷）的存在下，,-,半乳糖苷酶能作用,X-gal,（,5-,溴,-4-,氯,-3,吲哚,-,D-,半乳糖苷）形成蓝色化合物,5-,溴,-4-,氯靛蓝。,当这种质粒转化无,lacZ,基因的大肠杆菌时，由于质粒，由于,.,(四)噬菌体,概念,是侵染细菌、螺旋体、真菌等的病毒。,结构,温和噬菌体和毒性噬菌体,噬菌斑,是分子生物学中重要的,DNA,载体,目前广泛使用的噬菌体有,-,噬菌体，,M13,噬菌体，,野生的,-,噬菌体,线状双链,DNA,分子,在分子两端各有,12,个碱基的单链互补粘性末端,当,-,噬菌体,DNA,被注入寄生菌细胞后，会迅速通过黏性末端的互补作用形成双链环状,DNA,。,这种由黏性末端形成的双链区段，称为,COS,位点。,-,噬菌体,DNA,包含约,61,个基因，其中一半参与了噬菌体生命活动，这类基因称为,-,噬菌体必要基因,另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，这类基因称为非必要基因。,野生型,-,噬菌体本身不适合于作为载体，需要进行改造。,改造后的,-,噬菌体载体具有,在噬菌体非必要基因区制造多个单一的限制性内切酶区，以便外源性,DNA,片段的插入或取代。,引进某些突变以改变噬菌斑的颜色或形态，以便重组体的检出，如,-,半乳糖苷酶基因区等。,通过某些基因突变形成安全载体，以便利用生物学防护等。,（五）转化、转染、转导,转化,是指受体菌捕获和表达质粒载体,DNA,分子的生命过程。,细菌种属及细胞壁结构的差异，转化条件和过程均不一样。感受态。,即使同一菌属中，各菌株达到感受态的的条件和时机也存在差别。,氯化钙处理大肠杆菌以提高细胞膜的通透性。,转染,专指受体菌捕获和表达噬菌体,DNA,分子的过程。,转导,是利用噬菌体颗粒为媒介，将外源,DNA,转移至受体菌并得到表达的生命过程。,二、分子克隆的主要步骤,1.,基因文库的建立,变链菌,gtf,基因,染色体切成一定长度的,DNA,片段,DNA,连接酶整合至载体（质粒或噬菌体）,载体转化至大肠杆菌,每一个转化的大肠杆菌含有一个重组质粒，因此就含数万段重组质粒，因此就含有数万段个、变链菌,DNA,。,这数万段随机的变链菌,DNA,片段，应该包括该变链菌整个染色体。这个大肠杆菌集合体因为含有整个变链菌染色体而被称为变链菌的基因文库。,2.,目的基因的筛选,核酸杂交,免疫学检测,3.目的基因的分析,DNA,序列,启动子分析,推测蛋白质一级结构,推测蛋白质二级结构,三、特异性核酸的检测,（一）核酸分子杂交,1.,原理：,在一定条件下（温度、,pH,值等）,DNA,双股螺旋可解开并分离,在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股,2.,核酸分子杂交的技术过程,（,1,）探针的制备,（,2,）待测核酸的处理,（,3,）核酸杂交的类型,点杂交,Southern Blot,（1）斑点杂交,目标序列的存在,目标序列的量,（2）Southern Blot,电泳、转移、杂交,确定分子量,（二）聚合酶链反应PCR,1.PCR,原理,2.,用于,PCR,的,DNA,多聚酶,3.PCR,中的其他因素,4.PCR,应用,DNA电泳,可分离不同分子量的,DNA,Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder,对临床菌株的第二次,PCR,扩增产物电泳图谱分析,Lane 17:,临床菌株,S.sobrinus,;,Lane 814:,临床菌株,S.mutans,.,(,Kb),2.0,1.0,0.25,0.1,0.75,0.5,MW,与龋病相关微生物的定量检测方法,细菌形态,生化反应,免疫反应,分子生物学方法,-分子探针杂交,-,RFLP,-PCR,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,在人类口腔中检出率很高,茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切,变形链球菌和茸毛链球菌,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,套式,PCR,快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌.,谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.,中华口腔医学杂志，2003，38：223-226,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,套式,PCR(Nested PCR),5,3,Template,Outer primer2,Outer primer1,The first PCR,5,3,Inter primer2,Inter primer 1,Next template,The second PCR,5,3,The second PCR product,本套式,PCR,的引物是分别根据变形链球菌,gtfB,基因和茸毛链球菌,gtfI,基因设计的内、外两套引物（,outer primer,inter primer）,gtfB gene of S.mutans,Outer primer thp4,Outer primer thp3,The first PCR,Inter primer thp8,Inter primer thp7,Outer primer thp6,gtfI gene of S.sobrinus,Outer primer thp5,The first PCR,Inter primer thp10,Inter primer thp9,The second PCR,The second PCR,抽提细菌染色体,DNA(Igarashi et al.1996),-,细菌,-唾液,PCR,反应过程,第一次,PCR,反应,预变性:94 4,min,变性:94 1,min,退火:51 1,min 30cycles,延伸:72 2,min,最后延伸:72 5,min,第二次,PCR,反应,a b c d e f g h,Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8,选择外引物行第一次,PCR,后扩增产物电泳图谱分析,以变链菌组(,Mutans Streptococci),染色体,DNA,为模板,Lane 1:,S.cricetus,AHT;2.,S.rattus,BHT;3.,S.mutans,Ingbritt;,4,.S.sobrinus,OMZ176;5.,S.mutans,LM-7;6.,S.mutans,OMZ175;,7.,S.sobrinus,6715;8,.S.downei,Mfe28.,MW,(Kb)2.0,1.0,0.25,0.1,0.75,0.5,a b c d e f g h,Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8,选择内引物行第二次,PCR,后扩增产物电泳图谱分析,Lane 1:,S.cricetus,AHT;2.,S.rattus,BHT;3.,S.mutans,Ingbritt;,4.,S.sobrinus,OMZ176;5.,S.mutans,LM-7:6.,S.mutans,OMZ175;,7,.S.sobrinus,6715;8.,S.downei,Mfe28.Marker:DL2,000 Ladder,MW,(Kb)2.0,0.75,0.5,1.0,0.25,0.1,Ladder 1 2 3 4 5 6,第一次,PCR,的灵敏度,变形链球菌,S.mutans,Ingbritt,的数量,Lane1:10,8,CFU;Lane 2:10,7,CFU;,Lane3:10,6,CFU;Lane 4:10,5,CFU,MW,(,Kb),2.0,0.75,0.5,1.0,0.25,2.0,0.5,Ladder 1 2 3 4 5 6,1.0,0.75,0.25,MW,(Kb),第二次,PCR,的灵敏度,变形链球菌,S.mutans,Ingbritt,的数量,Lane 1:10,4,CFU,Lane 2:10,3,CFU,Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder,对临床菌株的第二次,PCR,扩增产物电泳图谱分析,Lane 17:,临床菌株,S.sobrinus,;,Lane 814:,临床菌株,S.mutans,.,(,Kb),2.0,1.0,0.25,0.1,0.75,0.5,MW,Ladder 1 2 3 4 5 Ladder,MW,1.0(Kb),0.75,0.5,0.25,0.1,Ladder 1 2 3 4 5 Ladder,MW,2.0(Kb),1.0,0.25,0.1,0.75,0.5,A,B,Lane1.chromosomal DNA from,S.mutans,Ingbritt;2.chromosomal DNA from,S.sobrinus,6715;3.saliva sample from subject A;4.saliva sample from subject B;,5.saliva sample from subject C.,利用,PCR,直接从唾液样本中检测变形链球菌,S.mutans,和茸毛链球菌,S.sobrinus(,图,A),利用外引物(图,B),利用内引物,二、分子克隆的主要步骤,原核生物基因文库的建立,提取细胞DNA,限制性内切酶酶切,DNA片段连接至质粒或噬菌体,转化宿主细胞（大肠杆菌）,