章DNA的复制和修复1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、填空题,1,、嘧啶核苷酸从头合成的第一个核苷酸是（），嘌呤核苷酸从头合成的第一个核苷酸是（）。,2,、,dTMP,的直接前体是（）。,3,、人类对嘌呤代谢的终产物是（）,4,、嘧啶合成中氨甲酰磷酸的合成以（）作为氨的供体，尿素循环中氨甲酰磷酸由（）作为氨的供体。,5,、与嘌呤环和嘧啶环的原子来源都有关的氨基酸是（）。,6,、治疗痛风可用（）来作为黄嘌呤氧化酶的自杀性底物。,7,、,5-FU,的抗癌作用机理是（）。,二、选择题,1.,下列哪种物质不是嘌呤核苷酸从头合成的直接原料？,A.,甘氨酸,B.,天冬氨酸,C.,苯丙氨酸,D.CO2 E.,一碳单位,2.,在细胞中自,UMP,合成,dTMP,的有关反应涉及,A.,四氢叶酸衍生物传递一碳单位,B.,四氢叶酸氧化成二氢叶酸,C.,中间产物为,dUDP D.,受,5-,氟尿嘧啶的抑制,E.,受,6-,巯基嘌呤的抑制,3,、嘌呤环,1,号,N,来源于（）,A,、,Gln,的酰胺,N B,、,Gln,的,-,氨基,N,C,、,Asn,的酰胺,N D,、,Asp,的,-,氨基,N,4,、鸟嘌呤是（）,A,、,2-,氧,-4-,氨基嘌呤,B,、,2-,氨基,-4-,氧嘌呤,C,、,2-,氨基,-6-,氧嘌呤,D,、,2-,氧,-6-,氨基嘌呤,5,、催化,5-,磷酸核糖和,ATP,作用生成,5-PRPP,的酶是（）,A,、核糖激酶,B,磷酸核糖激酶,C,三磷酸核苷酸激酶,D,磷酸核糖焦磷酸激酶,6、下列哪种化合物对嘌呤核苷酸的生物合成不产生直接反馈抑制作用（）,A、TMP B、IMP C、AMP D、GMP,7、最直接联系核苷酸代谢与糖代谢的物质是（）,A、葡萄糖 B、6-磷酸葡萄糖 C、1，6二磷酸葡萄糖D、5-磷酸核糖,8、AMP分子中第六位碳原子上的氨基来源于（）,A谷氨酰胺 B谷氨酸 C天冬氨酸 D天冬酰胺,9、催化dUMP转变为dTMP的酶是（）,A核苷酸还原酶 B胸甘酸合成酶 C脱氧胸甘激酶 D核苷酸激酶,三判断题,1、嘌呤核苷酸的从头合成是先闭环，再形成N糖苷键。,2、dUMP转变为dTMP的甲基供体是携带甲基的FH4。,3、核苷酸的从头合成和补救途径都需要PRPP。,4、氮杂丝氨酸的化学结构与Gln相似，它干扰Gln在核苷酸合成中提供氨基作用。,5、黄嘌呤氧化酶只能以黄嘌呤作为唯一底物。,6、脱氧核苷酸是由核糖核苷三磷酸经还原生成的。,DNA,的复制和修复,复制：,以亲代,DNA,或,RNA,为模板，根据,碱基配对的原则,，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代,DNA,或,RNA,的过程。,几个基本概念：,逆转录：,以,RNA,为模板，在,逆转录酶,的作用下，生成,DNA,的过程。,翻译：,亦叫转译，以,mRNA,为模板，将,mRNA,的密码解读成蛋白质的,氨基酸顺序,的过程。,转录：,以,DNA,为模板，按照碱基配对原则合成,RNA，,即将,DNA,所含的遗传信息传给,RNA，,形成一条,与,DNA,链互补的,RNA,的过程。,1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录,1953年，,Watson,和,Crick,提出中心法则：遗传信息的单向流动。,中心法则：,病毒（复制）,复制,转录,DNA RNA,蛋白质,翻译,逆转录,RNA,的复制存在于,RNA,病毒,DNA,是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在,DNA,分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过,DNA,的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自,DNA,转录给,RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,DNA,复制的可能方式的假设,全保留与全新复制,分散复制,半保留复制,一、,DNA,的半保留复制,2.半保留复制的实验证据:,1.定义：,1958年,Meselson,和,Stahl,用同位素,15,N,标记,大肠杆菌,DNA,首先证明了,DNA,的半保留复制。,以,亲代,DNA,双链,为模板以,碱基互补,方式合成子代,DNA，,这样新形成的子代,DNA,中，一条链来自亲代,DNA，,而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫,半保留复制,。,第一节,DNA,的复制,DNA,半保留复制图示：,半保留复制的证明：,Meselson,和,Stahl,将同位素,15,N,标记的,15,NH,4,Cl,加入大肠杆菌的培养基中培养,12,代，使大肠杆菌的,DNA,都带上,15,N,的标记，然后将该大肠杆菌转入,14,N,的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代,DNA，,进行,氯化铯,密度梯度离心，实验证明了,DNA,的半保留复制。,15,N-DNA,的密度大于,14,N-DNA,的密度,DNA,的半保留复制的生物学意义：,DNA,在代谢上的稳定性并非指,DNA,是一种惰性物质,，,是处于不断变异和发展之中,DNA,的半保留复制表明,DNA,在代谢上的,稳定性,，,是,保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。,二、,DNA,复制的半不连续性,1）冈崎片段和半不连续复制,问题的提出：,已知,DNA,两条链反向且都能作为模板；,已知,DNApol,聚合方向53；,冈崎等提出,DNA,的不连续复制模型，认为：,3 5走向的,DNA,是由许多53方向合成的,DNA,片段连接而成的。,冈崎片段：,以 5 3 走向,DNA,为模板合成的小片段。,约1000-2000,bp,。,半不连续复制的发现,同位素实验，用含,3,H,的,dT,标记用,T,4,噬菌体感染的大肠杆菌,短时间内分离的,DNA,均为,DNA,小片段,一段时间后,检测到,DNA,大片段。当用,DNA,连接酶的缺失的变异株时，检测到大量,DNA,片段的积累。证明,DNA,复制中有小片段合成。,测定,DNA,小片段，远远大于合成,DNA,的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于,U,替代,dT,渗入,DNA,中，而被尿嘧啶-,N-,糖基酶切除所致。,在缺少尿嘧啶-,N-,糖基酶的突变植株中，,DNA,的,U,不再被切除，则,检测到一半,3,H,标记出现在小片段（冈崎片段）中。,1968日本学者冈崎：,前导链,滞后链,冈崎片段,前导链：,以3 5 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。,滞后链：,以5 3方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。,其复制过程的复制起点呈现叉子的形式,故称复制叉,三、与,DNA,复制有关的酶和蛋白质,原料,：,四种脱氧核苷三磷酸,（,dATP、dGTP,dCTP,dTTP,),需要,模板,：,以,DNA,为模板链，合成子代,DNA,，,模板可以是双链，也可以是单链,DNA。,合成产物与模板互补。,需要,引物,：,一小段,RNA(,或,DNA）,为引物，在大肠杆 菌中，,DNA,的合成需要一段,RNA,链作为引物,，引物含,3,-,OH,.,合成方向：,5,3,(一),DNA,聚合酶：,1956年,Kornberg,等在大肠杆菌中首先发现,DNA,聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。,该酶的催化性质如下：,（二）大肠杆菌,DNA,聚合酶,（1）,5,3,聚合酶,功能（但持续合成,DNA,的能力差）；,（2）,3,5外切酶,活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；,（3）还具有,5,3外切酶,活性（双链有效）；,1、,DNA,聚合酶:,1956年,Kornberg,首先从,大肠杆菌,中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:,该酶缺失时大肠杆菌仍具有,DNA,合成酶活性，只是对,DNA,损伤的修复能力,下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对,DNA,损伤的修复，以及在,DNA,复制时,RNA,引物切除及其缺口的填补。,a.,聚合作用,在引物的3-,OH,末端，以,dNTP,为底物，按模板,DNA,上的指令由,DNA pol,逐个聚合上核苷酸。,酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板,DNA,配对时才有催化作用。,dNTP,进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-,OH,与5-,PO,4,结合生成磷酸二酯键。,DNA,聚合酶催化的反应：,b.35,外切酶活性（校对作用,）,35外切酶活性是从35方向识别和切除不配对的,DNA,生长链末端的核苷酸。,错误核苷酸进入,pol,的结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象而被35外切酶活性位点所识别并切除。,c.53,外切酶活性（切除修复作用）,53外切酶活性是从53方向水解,DNA,生长链前方的,DNA,链。它只作用具切口的双螺旋,DNA，,并在切口以外的配对区切割。,53外切酶活性在,DNA,损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5-末端,RNA,引物的去除依赖此种外切酶活性。,DNA,聚合酶的功能,2、,DNA,聚合酶：,多亚基酶，聚合作用，聚合活力比,DNA,聚合酶高；持续合成,DNA,的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有,DNA,合成能力，推测该酶仍然不是真正的,DNA,聚合酶。该酶,具有3,5外切酶活性,。其功能可能在,修复紫外光引起的,DNA,损伤,中起作用。,3、,DNA,聚合酶,多亚基酶，含,十种亚基,:,（,）,，,其中（,）,称为,核心酶,，,2,称为夹子，（,2,）,组成,复合物,，其主要功能是帮助,亚基夹住,DNA，,故称为,夹子装配器,，该酶,DNA,合成的,持续能力强,，主要与该结构有关。另外，该酶合成,速度大，活性高，,缺失时大肠杆菌因,DNA,复制抑制而致死。因此认为该酶,DNA,的真正复制酶,。,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,结构基因,不同种类的亚基数目,相对分子质量,35外切酶53外切酶,聚合速度（核苷酸/分）,持续合成能力,功能,Pol A,1,103,000,1,000-1,200,3-200,切除引物，修复,Pol B,7,88,000,2,400,1,500,修复,Pol C,10,830,000,15,000-60,000,500,000,复制,大肠杆菌三种,DNA,聚合酶比较,(三）,DNA,连接酶：连接,DNA,双链中的单链切口,作用特点：,大肠杆菌和其它细菌的,DNA,连接酶,要求,NAD,+,提供能量,；,在高等生物和噬菌体中，则要求,ATP,提供能量。,T,4,噬菌体的,DNA,连接酶不仅能连接,双链,DNA,上,的,粘性,切口，而且能连接无粘性末端的平头双链,DNA,。,DNA,连接酶,在,DNA,复制、损伤修复、重组,等过程中起重要作用。,1、拓扑异构酶,拓扑异构酶：,催化,DNA,的拓扑连环数发生变化的酶，在,DNA,重组修复和其它转变方面起重要作用。,除连环数不同外其它性质均相同的,DNA,分子称为,拓扑异构体,，引起拓扑异构体反应的酶称为,拓扑异构酶,。,(,四)与,DNA,合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中),两类拓扑异构酶作用特点:,口,2、解螺旋酶（解链酶）,通过水解,ATP,将,DNA,两条链打开。,E.coli,中的,rep,蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶,I、II、III。,每解开一对碱基需要水解2个,ATP,分子。,稳定,DNA,解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。,3、单链结合蛋白：,引发体可以沿模板链5,3方向移动,具有,识别合成起始位点,的功能，移动到一定位置上即可引发,RNA,引物的合成。移动和引发均需要,ATP,提供能量，,n,蛋白具有,ATP,酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与,冈崎片段,的合成方向相反。,4、引物合成酶与引发前体,引物合成酶：,催化引物,RNA,的生成,引发前体:,它由多种蛋白质,dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n,和,i,组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。,蛋白质,功能,相对分子量（10,3,）,分子/细胞,DNA,旋转酶（或拓扑异构酶）,DNA,解链酶,单链结合蛋白,引物合成酶,引入或松开超螺旋,使双链,DNA,解链,稳定单链区,合成,RNA,引物,400,65,74,60,50,300,100,（五）、参与,DNA,复制的酶与蛋白因子总览图,四、,DNA,的复制过程,1,、复制的起点与方向,（一）复制的起始,大肠杆菌双链,环状,DNA,的复制（,一个,复制起点，双向复制）,3,真核细胞,线状染色体,DNA,的复制方式（,多个,复制起点，双向复制）,单向,滚环式,复制（噬菌体,X174DNA,单链环状）,从复制原点到终点，组成一个,复制单位,，叫,复制子,（基因组独立进行复制的单位）。,DNA,的复制有特定的起始位点，叫做,复制原点,。常用,ori,C(,或,o）,表示。大肠杆菌的复制原点,ori,C,由245个,bp,构成，关键序列含两组保守的重复序列：三个13,bp,的序列（富含,A、T,的序列）和四个9,bp,的序列；许多生物的复制原点也都是,富含,A、T,的区段,。,复制原点,由,DnaA,蛋白识别，在原点由,DnaB,蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(,DNA,双链的解开还需,DNA,拓扑异构酶,、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫,复制眼,。,2,、起点的识别和双链的解开,（1）拓扑异构酶解开超螺旋。,（2）,Dna A,蛋白识别并在,ATP,存在下结合于四个9,bp,的重复序列。,（3）在类组蛋白（,HU、ATP,参与下,Dan A,蛋白变性13个,bp,的重复序列,形成开链复合物。,（4）,Dna B,借助于水解,ATP,产生的能量在,Dna C,的帮助下沿5,3 方向移动，解开,DNA,双链，形成前引发复合物。,（5）单链结合蛋白结合于单链。,（6）引物合成酶（,Dna G,蛋白）开始合成,RNA,引物。,3,、,RNA,引物的合成,（二）链的延伸,1,、冈崎片段的合成,真核生物的冈崎片段为：,100-200,bp,原核生物的冈崎片段为：,1000-2000,bp,2,、,DNA,链的延伸,在,DNA,聚合酶,的催化下，以四种5-脱氧核苷三磷酸为底物，在,RNA,引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。,DNA,链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。,前导链,滞后链,冈崎片段,半不连续复制,冈崎模型,（三）,DNA,复制的终止,DNA,复制的终点,在,DNA,上存在着复制终止位点，某些蛋白因子可识别终止位点的序列，使,DNA,复制在终止位点终止。,E.coli,的,DNA,复制终点序列：,AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT,TTAATCATACAACATTGATTTCA,大肠杆菌的两个复制叉在相距终点100,kb,时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。,大肠杆菌的两个复制叉在相距终点100,kb,时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。,DNA,复制时，当,RNA,引物被切除后，中间所遗留的间隙由,DNA,聚合所填充，最后由连接酶封口。形成两条与亲代链完全相同的两条子代链。,（四）、真核生物,DNA,复制,的特点,4、,真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体,DNA,复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用,更多的复制起点,。,1、,真核生物染色体有多个复制起点，称为,自主复制序列（,ARS）,或复制基因,(,replicator);,多复制眼，呈双向复制，多复制子。,2、,冈崎片段长约,200,bp,。,3、,真核生物,DNA,复制速度,比原核,慢,，速度为10003000,bp/min(,仅为原核生物的1/201/50）。,7、,RPA：,真核生物的单链结合蛋白。,5、,真核生物有,多种,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,（,）是真正的复制酶，在,PCNA,存在下有持续的合成能力。,PCNA,称为,增殖细胞核抗原,，相当于大肠杆菌,DNA,聚合酶,的,-,夹子，,RFC,蛋白相当于夹子装配器。,6、,真核生物线性染色体两端有,端粒结构,，它是由许多成串的重复短序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在消除,RNA,引物后造成的空缺，使染色体,保持,一定长度,。,端粒酶,是含一段,RNA,的逆转录酶.,逆转录（,reverse transcription）,1970年,Temin,等,和,Baltimore,分别从,劳氏肉瘤病毒,和小白鼠,白血病病毒,等致病,RNA,病毒中分离出,逆转录酶,，迄今已知的,致癌,RNA,病毒都含有逆转录酶。,定义:,以,RNA,为模板，按照,RNA,中的核苷酸顺序合成,DNA,的过程,称为逆转录，由逆转录酶催化进行。,用,特异抑制物,（放线菌素,D）,能抑制致癌,RNA,病毒的复制，而对一般,RNA,病毒的复制无影响。已知放线菌素,D,专门抑制以,DNA,为模板的反应，可见,致癌,RNA,病毒的复制过程必然涉及到,DNA,。,所以,Temin,于1964年提出,前病毒,的假说。,返回,第二节 逆转录,以前病毒形式整合到宿主细胞,DNA,中而使细胞恶性转化,单链病毒,RNA,RNA-DNA,杂交分子 双链,DNA（,前病毒）,逆转录酶也和,DNA,聚合酶一样，沿5,3方向合成,DNA，,底物为四种,dNTP,并要求短链,RNA,作引物。,逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,核糖核酸酶,H,的活性，专一水解,RNA-DNA,杂交分子中的,RNA，,可沿5,3方向起核酸外切酶的作用；,无校对功能，错误率高，易产生变异。,+,RNA+,DNA-,RNA+,DNA-,DNA+,致癌,RNA,病毒的逆转录过程,cDNA：,反义,DNA,几乎所有真核生物,mRNA,分子的3末端都有一段,polyA,当加入寡聚,dT,作为引物时，,mRNA,就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与该,mRNA,互补的,DNA，,称为,cDNA。,不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从,RNA,传递到,DNA。,促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。,1983年,发现人类免疫缺陷病毒(,human immune deficience virus,HIV),感染,T,淋巴细胞后即杀死细胞,造成宿主机体免疫系统损伤,引起艾滋病(,acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，,该病毒为,逆转录病毒。,逆转录酶发现的理论与实践意义：,第三节,DNA,损伤与修复,DNA,在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使,DNA,的结构及功能发生改变,。从而引起生物突变，甚至导致死亡。,DNA,的损伤,基因修复,“工程队”,错配修复,直接修复,切除修复,重组修复,SOS,修复,错配修复,通过一个酶系统修复,DNA,错配的碱基根据复制叉上,DNA,甲基化程度，切除尚未甲基化的子代链上的错配碱基,1、参与错配修复的酶与蛋白质,Dam,甲基化酶;,MutH、MutL、MutS,蛋白;,解螺旋酶;,DNA,聚合酶 ;,外切酶、；,DNA,连接酶；,SSB,甲基化指导的错配修复,甲基化指导的错配修复,(二)碱基的切除修复,（1）,碱基切除修复(,Base Excision Repair BER),DNA,糖苷酶(,glycosylase),识别损伤碱基并切开糖苷键,Ap,内切酶切开,Ap,位点附近的磷酸二酯键,DNA PolI,除去,DNA,链的损伤部分(5-3外切)并合成,连接酶封闭,（2）核苷酸切除修复(,Nucleotide Excision Repair NER),uvrABC,核酸酶切下含有损伤部位的一段,DNA,片段(约12,Nt)，,DNA PolI,填补缺口，连接酶封闭切口,切除修复对多种,DNA,损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。,DNA,解螺旋酶,（三）直接修复,（四）重组修复(,recombinational repair),重组修复不能完全去除损伤，损伤的,DNA,段落仍然保留在亲代,DNA,链上，只是重组修复后合成的,DNA,分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤,DNA,的。,（六）,SOS,反应和诱导修复（易错修复）,SOS,反应：,细胞,DNA,受到严重损伤或,DNA,复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。,SOS,反应包括:,避免差错的修复能力增强,诱导产生无校正功能的,DNA,聚合酶合成,抑制细胞分裂,SOS,反应是生物,在不利环境中求得生存,的一种基本功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。,第四节,DNA,复制的精确性（高保真复制）,1、碱基的配对规律：,摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/10,4,1/10,5,。,2、,DNA,聚合酶的35外切酶活性的校对功能，,使碱基的错配几率又降低1001000倍。,3、,DNA,的损伤修复系统。,DNA,复制必须具有,高度精确性,，在大肠杆菌的细胞,DNA,复制中其,错误率约为1/10,9,1/10,10,，,即每10,9,10,10,个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体,DNA,复制,100010000,次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,（一）名词解释,1.,半保留复制；,2.,冈崎片段；,(,二,),、单选题,1,DNA,复制时，下列哪一种酶是不需要的,A,DNA,指导的,DNA,聚合酶,B,DNA,连接酶,C,拓朴异构酶,D,解链酶,E,限制性内切酶,2.DNA,复制时，子链的合成是,A.,一条链,53,，另一条链,35 B,两条链均为,35,C,两条链均为,53 D,两条链均为连续合成,E,两条链均为不连续合成,3.,在,E.coli,细胞中,DNA,聚合酶,的作用主要是,A.DNA,复制,B.E.coliDNA,合成的起始,C.,切除,RNA,引物,D.,冈崎片段的连接,