第六章诱变育种.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 诱变育种,诱变育种就是,以人工手段诱发,微生物基因突变，改变遗传结构和功能，进而从,变异体中选育,出产量高、性状优的适合工业化生产的菌种的一项综合技术。,诱变育种中同时要找出发挥这个突变株优势的,最佳培养基和培养条件，,使其在最适的环境条件下合成有效产物。,诱变育种,诱变育种的主要用途,提高有效产物的产量；,改善菌种的特性，改进产品质量；,简化工艺条件；,开发新产品。,诱变育种工作包括,诱发突变,、,突变株的筛选,和,高产突变株最佳环境条件的调整,。,诱发突变,包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素。,突变株的筛选,包括筛选条件(培养基和培养条件)及选择一个简便、快速、有效的筛选方法。,环境条件调整,是突变株的最佳培养条件改变。,以上是决定诱变育种成败的三个方面，在育种开展之前，根据试验目的紧紧围绕三个环节制订试验方案。,诱变育种三阶段,第一节 诱变育种的设计和准备,第二节,诱变育种的步骤与方法,第三节 突变株的分离与筛选,第四节 营养缺陷型菌株的诱变和筛选,主要内容,第一节 诱变育种的设计和准备,出现不同菌落类型的原因,遗传原因,突变、原生质融合、异核体,非遗传原因,培养基：药品来源、规格、质量；厚薄不均,菌落稀释度,菌的不同生长阶段,2.全面了解菌种特性及其与生产性能的关系,通过对菌种生活史的考察，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性以及这些特性与代谢产物合成的相关性。,3.了解影响菌种生长发育的主要原因,培养基,培养基制备技术,药品和原材料的质量,移种的密度：宜稀不宜密,湿度,温度,4.建立一个准确、简便、快速检测产物的方法,研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件,6.,了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养基的关系,第二节 诱变育种的步骤和方法,诱变育种的步骤,包括以下内容：,一、出发菌株的选择与纯化；,二、菌悬液(单孢子或单细胞)的制备；,三、诱变剂及诱变剂量的选择；,四、诱变的处理；,五、筛选；,六、性能测定。,用于每代诱变的原始试验菌株称出发菌株。,出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节。,一、出发菌株的选择与纯化,1对出发菌株的一般要求,(1)从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株,(2)使用中的生产菌株,(3)具有某些有利性状的菌株 如生长速度快、营养要 求低以及产孢子早而多的菌株；,(4)已发生其他变异的菌株 如失去产色素能力的变异株,2.出发菌株的选择,选择具备一定生产能力或某些特性的菌株为出发菌株,选择纯种作为出发菌株,选择出发菌株应考虑其稳定性,选择连续诱变过的作为出发菌株,选择在表型上有改变，并伴随产量有显著提高的菌株。,选择具有增变基因变异的菌株作为出发菌株。,选择出发菌株的其他因素,如：产孢子较多、不产或少产色素、生活能力强、生长速度快、周期短以及糖氮利用快、耐消泡、粘度小等性状的菌株,采用多出发菌株,在没有详细研究特定出发菌株敏感性的条件下，而且又不能单纯用生产能力高的菌株作为惟一出发菌株时，,应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。,因此，诱变育种工作中，一般采用34个出发菌株，,在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。,根据菌种代谢特点确定出发菌株,了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。,如：有人曾研究过,肌苷酸,产生菌的代谢特性，发现,肌苷酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸降解酶及核苷酸、磷酸化酶的活性有关,，如果从,产生肌苷酸野生型,的枯草杆菌中筛选到,降解酶活性低,而,磷酸化酶活性强,的作为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。,3.,出发菌株的纯化,微生物菌种选育之前的出发菌株和新变种获得之后，都要进行分离，使菌种纯化。,在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞的均匀悬液状态,。原因：分散状态的单细胞可以均匀地接触诱变剂，可避免长出不纯菌落。,菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞用,生理盐水或缓冲液,制备而成，其质量将直接影响诱变效果。,二、菌悬液(单孢子或单细胞悬液)的制备,菌悬液制备的要求：,1.供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮,供试细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期，孢子应成熟而新鲜。,2.,培养条件和培养基都要经过试验确定,3.,制备菌悬液时要采用分散法,，力求90以上为单细胞或单孢子。,4,、菌悬液浓度,：细菌、放线菌：,10,8,个,/mL;,真菌孢子及酵母菌：,10,6,个,/mL,。,菌悬液制备方法,细 菌,前培养及,诱变菌悬,液制备,同步化,预培养,经,20-24h,培养的斜面移接到盛有基本培养基的摇瓶中,35-37,培养到对数期。,3-6,培养,1h,在同步化的菌液中加入一定浓度的,Pu,、,Py,或酵母膏，继续培养,20-60min,，置于,2,下保藏,10min,，离心洗涤，用预冷的缓冲液或生理盐水制成悬液，加入玻璃珠振荡,10min,，用无菌脱脂棉或滤膜过滤，调整浓度，备用。,离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉或,G,3,-G,5,玻璃过滤器,过滤，用血球计数法进行孢子计数，调整菌体浓度，供诱变处理。,产孢子的菌类,预培养,采用,成熟而新鲜的孢子,，并且置于液体培养基中振荡培养到孢子刚刚萌发（即芽长相当孢子直径,0.5,-1倍）。,制备悬液,有三种方法：,菌丝尖端法。,取灭菌后的盖玻片或玻璃纸，贴于营养平板上，其上滴上数滴培养基，接上菌丝，培养后菌丝生长延伸到盖片以外的培养基上，揭去盖片，,使盖片周围部分尖端菌丝断裂而留在营养平板上，然后对这些菌丝进行诱变处理,。,不产孢子的真菌,单菌落周围菌丝尖端法。,通过自然分离，平板上选择数个单菌落，利用紫外线,对菌落四周延伸的菌丝尖端,进行照射或加入杀菌率低的化学诱变剂处理。培养一定时间，经过繁殖使突变的遗传性状统一、稳定，,挑取顶部尖端一小段菌丝,于斜面，培养后进一步摇瓶筛选。,混合处理法。,常用于化学诱变剂，,取培养后相当年幼的菌丝体,，用玻璃匀浆、过滤，取小段菌丝的菌悬液进行处理。,三、诱变剂及处理剂量的选择,诱变剂种类的选择取决于诱变剂作用的特性和出发菌株的特性及其诱变史。,结合菌种特性，根据诱变剂作用机制来选择,（一）诱变剂种类的选择,如：头孢菌素,C,产生菌的有效诱变剂是：,uv,、,LiCl,2,烷化剂；青霉素产生菌以烷化剂更合适。,a.,遗传稳定的出发菌株：,最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理,，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理。,根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂,b.,遗传性不稳定的出发菌株：它们的遗传背景是复杂的，为了提高这类菌株的产量，常可采取这样的选育路线：,自然分离,原始菌株,出发菌株,环境条件,突变体筛选,效价高、性能好的一类菌落,温和诱变剂处理,选用的诱变剂是温和的或曾经是有效的诱变剂,参考出发菌株,原有的诱变系谱,来选择诱变剂,诱变之前要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析、总结规律性。,有的菌株对某种或某一组合诱变因子是敏感的，特别是诱变史短的或野生型菌株。,为了成功地选育具有某种特性的生产菌种，就要选择一种最佳的诱变剂。对此，,事先需要做预备实验！,可采用,生产能力分类法,来直接比较其效果。通常做法：,取几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱变试验,，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的测定，作出生产能力分布状况。然后分别统计它们的,正突变株、负突变株和稳定株,的频率。,（二）最适诱变剂量的选择,诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。（正突高峰）,诱变剂量的选择是个复杂的问题，不单纯是,剂量与突变率之间的关系,，还涉及菌种,遗传特性、诱变史、诱变剂种类与处理环境,等很多因素。,判断诱变剂量时的指示突变：采用抗药性突变是比较可靠的,。因为抗药性突变表型明显，易于测定，同时其突变机制主要是基因突变，对诱变效应具有代表性。,1.,诱变剂量的确定,突变剂量曲线,大剂量处理：,杀菌率高(90-99)，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。,但在不多的正变株中可能筛选到产量大幅度提高的突变株。,2.,诱变剂对产量性状的诱变作用，大致有如下趋向：,小剂量进行诱变处理：,杀菌率约50-80，,在单位存活细胞中正突变株多，然而大幅度提高产量的菌株可能较少。,一般，经长期诱变的高产菌株，正变率的高峰多出现在低剂量区，负变率的高峰出现在较高剂量区,。,3.,诱变剂量的控制方法,b.,物理法,照射源、照射距离、照射时间、处理条件,a.,化学法,浓度、处理时间、处理条件,四、诱变处理,可分为单因子处理和复合因子处理两种方式。,单因子处理：采用单一诱变剂处理。,1.,诱变处理方式,复合因子处理是指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变,。复合因子适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。,复合因子处理又可分如下几种方式：,a,两个以上因子同时处理,即不同的诱变剂同时处理菌体，诱发其突变。,b,不同诱变剂交替处理,通常以化学因子和物理因子交替进行效果较好。交替处理时，诱变剂量宜适中或偏低。,*采用多种不同机制的诱变剂交替使用，可以动摇多种基因的稳定性，造成各种基因功能重新调整而产生丰富多彩的突变类型，提高变异率。,c.,同一种诱变剂连续重复使用,经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时之后(细菌或酵母)，使细胞分裂1-2代，接着再处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。,某些,诱变能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续重复使用，有益于变异率的提高。,d,紫外线光复活交替处理,经紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日光中一定时间，接着用剂量更大的紫外线继续照射，然后再让其光照复活，经多次紫外线照射和光照复活交替，可以增加变异率，提高变异幅度。,复合因子处理中，为了提高诱变效果，具体使用时，要注意,诱变剂的协同效应,。,先用弱诱变因子，后用强诱变因子处理往往具有协同效应，,反之，则使变异率下降，处理之前要根据不同菌种做预备试验或参考前人的经验来决定。,a.,直,接处理法：,先对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株。,b.,生长过程中处理方法：,适用于诱变强而杀菌率低的诱变剂，或只对,DNA,复制起作用的诱变剂。,具体做法有：将诱变剂加入培养基倒平板；将诱变剂涂抹在平板表面；摇瓶振荡培养中加入诱变剂。,2.,诱变处理方法,五、影响突变率的因素,(一)菌种遗传特性和生理状态,(二)菌体细胞壁结构,(三)环境条件的影响,出发菌株在,诱变前后的培养条件和诱变处理过程中的环境条件,对突变率有相当的影响，归纳起来影响的因素有如下几个方面：,1预培养和后培养,一个菌株在诱变剂处理前，通常要进行预培养，特别是细菌和酵母菌。,实验证明，出发菌株不管在诱变前或诱变后进行培养时，,营养丰富的培养基中出现突变株的数量总是比营养贫乏的培养基中多。,后培养的重要作用,后培养是指诱变后的菌悬液不直接涂平板分离，而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。目的：,是诱变处理后发生的突变，通过,DNA,修复、繁殖，才能形成一个稳定突变体；,使各种表型都有充分表达的机会，避免表型延迟现象。,2.温度、,pH、,氧气等外界条件对诱变效应的影响,pH,效应：,化学诱变剂作用时，需要在最适的、稳定,pH,值范围才表现出良好的诱变效应。,某些诱变剂在不同,pH,值下会形成不同分解产物，如亚硝基胍，在,pH 6.0,时可分解成亚硝酸，在,pH 8.0,以上，会形成重氯甲烷，因而产生不同的诱变效应。,供氧,情况：,一些辐射因子,和紫外线的诱变效应与供氧有密切的关系，如,x,射线辐射大肠杆菌时，在相同剂量条件下，供氧充足时，与,DNA,作用剧烈，损伤力大，反之则损伤小。,温度的影响：,随着菌种特性和诱变剂种类不同而异。,化学诱变因子的反应速度在一定范围内随着温度的提高而加速。,3.平皿密度效应,诱变处理后的菌悬液分离在平皿上的密度要适中，不能过密。,实验证明，随着加入到平皿中原氧型菌数的增加，营养缺陷型的回复突变率将减少。,密度过大还会影响突变体的检出。,第三节 突变株的分离与筛选,一、诱变育种的基本环节,在通过各种手段改变菌体的遗传性状之后，,如何将具有所需特性的菌种从数量庞大的群体中筛选出来，常是育种上,至关重要也是最耗时费力,的工作。,筛选的条件决定选育的方向。是决定某菌种去留的“筛子”。,质量性状变异：,如,抗性突变株或营养缺陷突变株,，常常用,选择性培养基进行筛选,。,产量性状变异：,其菌落表型几乎和出发菌株相同，,高产菌株和负变菌株都能在同一个培养基上生长,，没有明显指示性。,难以采用选择性培养法进行筛选。,随机筛选(,random selection),的方式：大量筛选无特定标志的变异株，往往必须筛选上万株菌才能找到一株较好的变异株。,定向筛选(,rational selection),技术,：先筛选具有某一特性的变异株，再由其中筛选出高产的菌株，大大提高筛选品质与效率。,如：赖氨酸生产菌的育种（筛选苏氨酸营养缺陷型）,一）常规筛选程序,二、筛选的程序,将随机挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定,二）定向筛选程序,改进之处：预筛采用琼脂块法。初筛摇瓶发酵液中产物的分析采用简便、快速的琼脂平板测定法。,预筛,部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。,如目标产物与色素之间具有一定相关性。,1根据,形态,筛选变株,原来具有较高发酵水平的菌种作为出发菌株时，,由突变引起形态剧烈变化的菌落是一些代谢严重失调的菌株，常常负变菌株占多数，,而突变的高产菌株其菌落形态往往处在常态的正常范围内,。,三、菌落预筛的方法,2根据,平板菌落生化反应,筛选变株,通过琼脂平板上的透明圈、呈色圈,、,抑制圈及混浊圈等生化反应来筛选,水解酶、有机酸及抗生素,等有益代谢产物产生菌。,这些方法可直接在琼脂平板上定性和半定量检测出微生物产物，它们不仅可用于野生种的筛选，而且，也可用于诱变后高产突变株的筛选。,3.采用,冷敏感菌筛选抗生素变株,冷敏感菌是从人的病原菌中经诱变分离出的低温敏感变异株，在20下不能生长，可作为检验菌使用。,操作：冷敏菌和诱变后的放线菌孢子悬浮液,混合,在同一培养基平板上，,置于20培养3-4,d,，抗生素产生菌正常形成菌落。,当菌落已经成熟，并且,抗生素产量已达高峰时,，将培养皿移至冷敏菌生长最适的温度,(37)下培养18-20,h,，,冷敏菌迅速生长，但在抗生素产生菌菌落周围的冷敏菌因生长受到抗生素的抑制而形成抑菌圈。,根据菌落直径与抑菌圈直径之比的有效值，直接筛选出抗生素高产突变株。,也用于从土壤等试样中,分离新抗生素产生菌,。,4浓度梯度法,一个菌株合成抗生素的水平与其耐自身产物能力大小有关。耐受性越强，抗生素产生能力也越强。,为此，分离突变株时，可以在平皿中加入该菌株所产生的抗生素，用双层法制成浓度梯度平板，其上分离一定稀释度的菌体细胞或孢子，培养后长出菌落，,挑取高浓度抗生素区域的菌落，易于筛选到抗性变株,。,5应用影印技术快速筛选突变株,应用影印技术从平板上可直接筛选产脂野生株和具有高脂含量的突变株,，是,产脂微生物,的简便检测方法。,采用该方法时，应选择一种,合适的染色方法,，使染料既不能被细胞利用，又能渗入细胞的油滴内，同时可指示脂肪累积的浓度，从而筛选,平板上的高脂含量突变株,。,采用该法时要注意,合理设计筛选培养基,，因为一般产脂酵母只有在培养基中,氮素耗尽并且有过量碳素,用于脂类合成时，才能在细胞内累积较多的脂类。,6,琼脂块法,大通量筛选突变株,该法是日本学者八木建立的，而由,Ichilawa,等在春雷霉素产生菌选育中得到应用，取得令人满意的效果。,在我国也广泛应用于,抗生素和酶类,等突变株的筛选。,由于琼脂块法应用巧妙的实验技术，其筛选的准确性比直接平板上特异性反应圈,更加可靠,，而且方法,较为简便，筛选量很大,，一次可筛选琼脂块上的菌落达,l000-3000,个或更高。,摇瓶,培养条件接近于,发酵罐,，是好氧工业微生物菌种实验的重要手段，可以作为发酵工艺模拟试验，这样选出来的变株易推广到大生产中去。,四、摇瓶液体培养,摇瓶培养通常可分初筛和复筛。,初筛：每株接种,1,瓶。,凡是生产能力比出发菌株高10以上的菌株，放入4冰箱或用沙土管、冷冻管保藏。,复筛：将保藏菌株用斜面活化后，每个菌株接种3-5瓶，,以提高重演性。必要时还要用两种以上培养基进行筛选，以防漏筛。,活性测定是菌种筛选工作的重要组成部分，也是决定筛选效率的主要因素。,通常，每种代谢产物都有各自的经典方法，这些方法,本身是精确的,，在样品少的情况下，具有相当的可信度。但经典法往往操作繁琐，从样品处理到测定完毕要花费较长时间，,结果使产物失活而带来误差,，失去可比性。,因此，在筛选工作中寻找并建立一个简便、快速、又较准确的检验方法显得十分重要。,五、产物活性测定,几个常用于摇瓶初筛阶段测定产物的简便、易行的方法,1琼脂平板活性圈法（圆孔法）,该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的,打孔器取出琼脂块,，在留下的,圆孔中加入发酵液,，,在适合温度下培养一定时间，测量圆孔周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性圈的大小挑选高产菌株。,2纸片法,随着诱变代数的增加，有效产物浓度不断提高，当发酵液中,产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛,。此时可改用纸片法。,具体做法是：取,直径0.5,cm,圆纸片,，灭菌后覆于含底物或检菌的琼脂平板上，准确取发酵液1-2,l,在滤纸片上，置于一定温度下培养20-25,h，,测量水解圈大小。,如果活性圈仍然很大(,15mm,以上)，则可将发酵液稀释，或者增加底物的浓度和琼脂板的厚度，使水解圈控制在一定范围内。,3琼脂薄层纸片法,此法更适合,抗真菌抗生素和农业抗生素野生菌的初筛和诱变菌株的初筛,。,具体做法为：将制备的,病原菌孢子悬液,，加入45-50的培养基中，混匀倾倒于,26,cm x16cm,无菌玻璃板,上，均匀摊平，制成厚度约1,mm,的薄层琼脂板。将圆滤纸片依次覆于板上，每块玻璃板可排5行，每行15-18个，编号，用移液器分别加1-2,ul,发酵液。在玻璃板两端底部各放上一块条状的玻璃，作垫子，上盖一块灭菌过的玻璃板。然后，把它们放入底部置有浸湿纱布的搪瓷盘，以便保湿。加盖，于适宜的温度下培养大约3-4,d。,置于解剖镜或立体显微镜下观察孢子萌发，菌丝形态，并测量抑菌圈大小。,为了提高育种效率，在大的布局上，应采用,快速循环筛选法,，即几条循环线同时进行筛选。,如：若完成一次循环需要40,d，,那么每隔10,d,进行一条筛选线，使,4条循环线交错进行,，每条循环线使用不同的出发菌株、诱变剂及不同的培养条件。,六、数据的统计分析,七、培养基和培养条件的调整,八、变种的特性研究与鉴定,第四节 营养缺陷型菌株的诱变和筛选,从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为,野生型菌株(,wild type strain)。,野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养(氨基酸、维生素、核酸等)的能力，只有在基本培养基上补充所缺乏的营养因子才能生长，称为,营养缺陷型菌株(,auxotroph strain)。,营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，称为,原养型(,prototroph)。,营养缺陷型菌株,在筛选营养缺陷型菌株过程中，有关的培养基有三类。,基本培养基(,minimal medium，MM)：,仅能满足野生型菌株生长需要的培养基,，称为基础培养基，有时用“-”表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。,完全培养基(,complete medium，CM)：,可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基,，称为完全培养基，有时用“+”表示。完全培养基营养丰富、全面，一般可在基本培养基中加入富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质配制而成。,补充培养基(,supplemental medium，SM)：,只能满足相应的营养缺陷型生长需要的合成培养基,，称为补充培养基。它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成的。根据所加营养因子的种类不同而用,A,或,B,等来表示。,营养缺陷型菌株的筛选,一般包括诱发突变、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴别缺陷种类,等步骤。,(一)营养缺陷型的诱变,用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10。,影响缺陷型突变率的因子很多，除,诱变剂种类,之外，与,诱变剂量,也有很大关系，一般随处理剂量的提高突变频率也增加。,一、营养缺陷型菌株的诱变和筛选,(二)淘汰野生型菌株,常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法等。,1抗生素法,常用于,细菌和真菌,营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。,青霉素法的原理：,细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。,处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于静止状态的细菌。,将诱变处理后的菌悬液接种到,加有抗生素的基本培养基,中，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的,。,制霉菌素法的原理：,制霉菌素,作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌,，起到富集营养缺陷型菌株的作用。,(1)将诱变处理后的菌体,用完全培养基振荡培养2-3代以结束表型延迟现象,，达到稳定的表型和生理状况。,(2)将经完全培养基培养后的菌体进行离心、洗涤，转移到,无氮基本培养中,进行饥饿培养4-6,h，,以消耗从完全培养基中摄取并储存在体内的氮素营养，使其停止生长,，防止被以后加入的青霉素杀死。,采用青霉素法淘汰野生型细菌的方法和步骤：,(3)转移到,含无机氮的基本培养基,中培养3-4,h，,使野生型细胞刚刚进入对数期。,加入一定浓度的青霉素,。在处理过程中，可以在基本培养基中,加入20蔗糖,以提高渗透压。,阻止死亡的野生型细胞原生质体破裂外渗，使缺陷型菌株免遭杀伤,。然后再把培养物移入到,不含青霉素的低渗溶液中，稀释，涂皿分离,。,(4)经平皿培养后，统计完全培养基和基本培养基平皿上菌落的差数，确定哪一组样品中含缺陷型数量最大，则可从该试验中进一步分离营养缺陷型。,2菌丝过滤法,真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发并长成菌丝，而营养缺陷型孢子则不能萌发。,把诱变处理后的孢子移入到,基本培养液,中，振荡,培养,10,h,左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗,过滤,除去菌丝，继续培养，每隔3-4,h,过滤一次，,重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞,。然后稀释，涂皿分离。,3高温杀菌法,适用于芽孢菌,利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热的敏感性差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌转移到,基本培养液,中,，振荡培养一定时问，野生型芽孢荫发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物,加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留,，起到了浓缩作用。,诱变后，要设法把缺陷型从浓缩后的野生型细胞和营养缺陷型细胞混合群体中分离检出，有关方法如下：,1,点植对照法,(三)营养缺陷型的检出,该法可靠性强，但工作量很大。,2影印法,该法效率高，适用于细菌、酵母菌及小型菌落的放线菌和霉菌。,采用影印法检出霉菌营养缺陷型时，要注意两点：,第一，防止菌落扩散和蔓延：,可以在培养基中加入0.5左右的脱氧胆酸钠，或在基本培养基中用山梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖使菌落长得小而紧密；,第二，克服孢子扩散而带来不纯现象：,当诱变后分离在完全培养基上的菌落尚未形成孢子之前，用一张灭菌的薄纸覆盖琼脂平板上，继续培养，待菌落的菌丝长到纸上后，把纸转移到对照平板上。此时薄纸上的菌丝向基本培养基表面生长，便在相应位置上长出菌落。,也称延迟补给法,。先在培养皿底部倒入一层基本培养基，凝固后，倒入含有菌体细胞的基本培养基，待凝固后，继续加第三层基本培养基。培养后平板上首先出现的菌落为野生型菌落。此时在平皿底部做好颜色标记。接着加上一层完全培养基，经培养，如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落，可能是营养缺陷型。进一步复证确认。,本法用于细菌更为合适。,3.夹层法,（,1,）如果试验的目的仅是,检出营养缺陷型,菌株，则其方法是将富集培养后的细胞接种到,含有0.01蛋白陈的基本培养基上,，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称,限量培养,。,（,2,）如果试验目的是要,定向筛选某种特定的缺陷型,，则可在基本培养基中,加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质,，称为,补充培养,。补充这些物质的数量可根据已有缺陷型进行测定后加以确定。,4限量补充培养法,营养缺陷型的鉴定，实际上就是测定营养缺陷菌株,所需生长因子的种类,。,通过营养缺陷型检出，仅仅了解突变体属于营养缺陷型菌株，只有通过鉴别测定，才能确定菌株属于哪一类营养缺陷型(如氨基酸类、维生素类、核苷酸类营养缺陷型等)或更具体的是缺陷哪一种营养因子。,(四)营养缺陷型的鉴定,1鉴定方法,在一个平皿中加入,一种营养物质,以测定,多株缺陷型菌株,(10-50株)对该生长因子的需求情况。,在同一平皿上测定,一种缺陷型菌株,对,多种生长因子,的需求情况，,称为生长谱法,。,2营养缺陷型鉴定步骤,测定缺陷型菌株所需生长因子的类别,具体测定缺陷该类别物质中的哪种生长因子,用单一生长因子进行复证试验,先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质。,氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陈，代表氨基酸类。,酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均具有。,维生素混合物，代表维生素类。,核酸碱基混合液或酵母核酸(0.1碱水解物)，代表嘌呤、嘧啶类。,A,缺陷型类别的测定,方法：将待测微生物制成浓度为10,6,-10,8,m1,-1,的菌悬液，,取0.1,m1,加入到基本培养其中，混匀倒入平皿，制成平板,。凝固后，,用圆滤纸分别浸湿沾取以上四类代表物质，覆于平板标定的位置上,。培养后，观察圆滤纸片周围菌株生长情况，如出现混浊的生长圈，就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别，进一步复证。,缺陷型菌株经过鉴定，明确缺陷哪一类生长因子之后，接着就要具体鉴定其缺陷哪一种生长因子，或哪两种或三种生长因子。,假如要鉴定单缺陷氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是,分组测定法,。把21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。如果以15种氨基酸或维生素进行测定，则把5种不同氨基酸或维生素归为一组，共5个组合。,B,缺陷型所需生长因子的测定,测定方法：,将缺陷型菌株与基本培养基混合制成平板,，把,5组或6组生长因子,直接点加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察,哪一组或哪两个组区产生混浊生长圈,，即可确定该菌株缺陷的生长因子。,二、营养缺陷型突变株的应用,生产实践中,:,营养缺陷型可用于,工业微生物育种，协助解除,代谢反馈调控,，从而达到大量积累终产物的目的(详见代谢调节控制育种)；也可将营养缺陷型菌株作为杂交、重组育种时的,遗传标记,(参照杂交育种有关章节)。,基础理论中：营养缺陷型不仅被广泛应用于,阐明微生物代谢途径,上，而且,在遗传学上具有特殊的地位,。在遗传规律中的转化、转导、接合、转座等的研究中，营养缺陷型是最常用的菌种标记。,天冬氨酸,氨基酸合成代谢的人工控制,赖氨酸高产菌,中间产物,天冬氨酸激酶,中间产物,甲硫氨酸,苏氨酸,高丝氨酸,高丝氨酸,脱氢酶,不能合成,可以大量积累,赖 氨 酸,人工诱变的,菌种不能产生,思考题,1,、何谓诱变育种？诱变育种的主要步骤是什么？,2,、诱变剂对产量性状的诱变作用有何特点？,3,、请设计一个获得营养缺陷型菌株的诱变育种实验方案。,