中枢神经系统创新药物筛选和评价.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,目 前 进 展 情 况,在生命科学进入“后基因组时代”后，创新性药物研制在新的基础上有快速发展，特别表现在可以从大量未知化合物大规模进行药理效应的评价，从而快速找到有开发前景的候选药物。,中枢神经系统创新药物研究在新的时代应当有较快的发展,1,背 景,据美国1998年的统计资料，中枢神经系统患病人数（8000万人）是心血管系统（4000万人）的一倍，而中枢神经系统药物全球的销售量（200亿美元）仅为心血管系统药物（600亿美元）的1/3，要达到心血管系统药物同样的水平，还需要增加500%的发展速度。,神经变性性疾病、脑血管疾病等，都还缺乏有效的治疗药物。,2,一、现有药物筛选和评价技术,筛选为体外初步评价化合物药效的方法,评价为动物模型进一步确定药效的方法,3,对现有筛选技术的评价,上述技术系统中，DNA和蛋白芯片针对分子变化，但不能准确反映哪种分子的增加或减少对疾病起主导作用，哪些是伴随现象；且实际需要的费用较昂贵，结果解析常常有困难，因此，对药物筛选的价值受到限制。相比之下，细胞水平筛选技术具有较大的优点。细胞是生命体的基本单位，可以反映生命活动中多种信号转导特征。,现在，已经能够对细胞各种功能分子及信号转导进行高效率检测。,6,总RNA抽提及纯化,RNA质量判定标准：,A.RNA样本的OD260/OD280应在1.7-2.2之间。,B.总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带。,C.70 水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴温前的图谱无明显差异。,7,2、现有评价技术,1）转基因动物模型：采用基因增强、基因敲除、基因抑制等基因打靶方法，培育出一批基因型改变的动物，对了解单个基因在生命活动中的作用起了重要作用；同时也为药物评价提供了有力的方法基础,缺点：,1各种疾病过程是多基因功能的共同作用的结果，单一基因改变不能准确反映疾病特征；,2由于生命体有复杂而完善的功能协调系统，单一基因改变往往由于代偿作用而得不到表现,3单一基因改变可激活继发性功能改变，药物作用可能不是原发性作用。,8,2、现有评价技术,2）整体动物客观、定量、高效评价方法：,近年来，出现利用光学信号、影像学、行为学方法对批量动物进行客观、定量、动态药效学观察，使得整体动物药效评价可以达到高效率要求。因此，提出了整体水平高效率筛选药物的观点。,9,3、,生物信息学在药物研究中的应用,生物信息学就是收集研究资料，建立国际水平的数据库，全世界研究者均可以利用这些数据来指导自身的研究。,目前基因、基因组及蛋白的数据库比较完善，研究者可以有效地利用这些资源来作为研究的参照。,药理学研究也需有这样的数据库来支持。,10,4、,存在问题和发展方向,1）药物靶分子的实用化，包括在分子、细胞和整体水平的应用,2）海量数据的有效收集及转化成有价值的信息,3）药物ADME和毒性的早期研究，回忆进入临床研究的速度。,4）整体水平研究的质量和效率，特别在客观、定量、简便、快捷和计算机技术的采用,5）各种水平药效评价指标与临床疾病的符合程度,11,二、改进和创新中枢神经系统药物筛选和评价技术,中枢神经系统药物研究除了与其他系统有相同的特点之外，还有其特殊性。在药效评价方面往往需要观察行为活动变化，细胞及分子变化往往不能准确反映临床效应，更需要在研究方法上有所探索和创新。,12,目前对脑缺血有保护性的药物沿缺少，因此有非常重要的社会意义与研究前景，下面以脑缺血药物研究为例对创新药物的筛选和评价作一叙述。,总的思路：在神经元保护和神经功能再建两个方面在体外初步评价化合物，在脑缺血疾病模型确定药效，建立分子-细胞-脑片-动物模型的药物筛选和评价的标准，形成一套规范化的研究工作程序，对确认有效的药物，将进行作用机制研究及新靶点的探索。,13,1、,以脑缺血功能变化作为,筛选、评价的导向,1）分子细胞药物筛选模型：采用分子靶向和功能导向两种策略。,分子靶向拟建立NMDA受体、半胱氨酸白三烯受体等损伤相关分子转染细胞株；,功能导向以抗急性损伤作用和促进神经再生两个方面评价药物效应。,14,2）离体脑片模型：脑组织切成薄片在人工条件下孵育，进行各种人工干预，是离体水平研究脑功能及药物作用的重要方法。,离体脑片介于整体与细胞水平实验之间，既保持了脑片内神经元与其他神经元、胶质细胞等的相互关系，又能在严格控制的条件下进行实验观察。,在离体脑片上可以观察活性、电生理特点和形态变化特点,实例：大鼠海马和小鼠皮层/纹状体脑片的OGD诱导的离体缺血模型。用TTC染色后色素定量分析、染色图像分析以及切片形态学分析等方法，用客观定量方法探讨在不同条件下的缺血损伤特点以及治疗药物的作用。,1、,以脑缺血功能变化作为,筛选、评价的导向,15,3）脑损伤动物模型：不同动物整体模型在反映疾病特点方面各有优缺点，因此，完整的药理学评价当采用同一疾病的多种动物模型。在脑缺血研究中采用了大鼠、小鼠，以及全脑缺血和局灶性缺血模型，这样可从多个侧面了解疾病发生和治疗药物作用特征,1、,以脑缺血功能变化作为,筛选、评价的导向,16,2、,提高药效评价的客观、定量程度和效率,1）计算机辅助实验系统：用计算机辅助技术来改进实验的客观、定量、效率。用该系统的视频跟踪、图像分析和生物信号处理等方面的功能，来对以下实验分析方法进行了创新和改进：,17,（1）自发活动测定：采用视频跟踪的技术，自动识别多个动物的行动轨迹，提高了检测的准确程度和实验效率，能客观、定量、直观地分析结果。,（2）小鼠偏瘫测定：应用视频跟踪技术，将局灶性脑缺血小鼠悬挂于墙壁，根据转动方向和角度，提出了一套定量指标，使定性描述定量化。,18,（3）脑缺血图像分析：利用实验组的概念，除了可以计算各项面积参数，还可以计算体积指标，并提供自动识别区域和手工划分区域，可由用户根据具体的情况自由选择。,（4）生物信号处理：MedLab5.0用于测量各种压力、张力、电信号,（5）其他：还能测定水迷宫轨迹、条件性位置偏爱、细胞判别和计数、电泳条带分析等实验数据。,19,2）以光信号检测脑损伤：,在缺血损伤后根据脑片透光性改变来评价脑片活性变化。透光法对脑组织不作前处理，可以进一步作其他指标检测，提高脑组织样本的利用率和研究效率；结合计算机图像分析技术，就可以得到客观定量数据，值得继续完善并用于神经药理学研究,20,3）定量测定脑片损伤,脑片在OGD或其他损伤因素作用下，线粒体酶活性降低，可使脑组织分解2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）产生红色产生减少。该方法是客观、灵敏、快速定量离体脑组织缺血性损伤及药物保护作用的客观简便的方法,21,3、提高研究模型系统对临床疗效的预测程度,建立体外神经保护及促进神经再生的筛选系统，以及整体水平综合评价系统，每个系统均有多个指标，离体或整体研究均采用2-3种以上的方法，并且将采用观察脑缺血后较长时间内的变化，并注重实验工作的规范性。这样，可以期望最大程度地减少假阳性或假阴性结果，确保筛选评价结果的可靠程度,22,4、结合作用机制研究,对创新性药物研究，须在基础水平上阐明药物通过什么途径发挥治疗作用。研制一类新药，除了要有系统的药效评价，还需要说明药物作用机制，这也是研究成果被国际认可的必要环节。特别在发现某种新型药物分子结构，能够阐明其新型的作用机制，寻找药物筛选的新的靶分子，是促进治疗药物研究或生命现象探索的重要方式，也是后基因组时代药理学研究所追求的目标。,23,4、结合作用机制研究,1）参与脑缺血损伤的受体分子：例如NMDA受体参与急性脑损伤调节等对筛选出有效的药物，可进一步观察对NMDA受体转基因细胞株的作用特点，并确定这些转基因细胞株能否作为后抗脑损伤药物筛选、评价的基本模型,2）对脑缺血相关的调节过程：对筛选出的药物，根据其作用特点，有选择地对其神经元功能调节特点，如神经元电生理、自由基产生、神经元凋亡、神经营养因子表达进行分析，阐明药物的作用位点。此外，还可适当采用基因芯片或蛋白芯片技术,24,3）损伤后及药物作用后神经元蛋白表达谱：利用蛋白组学研究，对神经元OGD损伤后，或正常神经元及OGD损伤神经元在药物作用后，提取神经元蛋白，在双向电泳后，确定表达改变的蛋白，并将该蛋白作质谱分析，解析其氨基酸序列，并确定是否为已知的或求知的蛋白。利用该方法可以较快寻找相关的功能靶分子，为药物研究提供新的靶点,25,5、重视药物信息学平台的建设,药物研究数据库的建立对于保存、集成、规范和指导研究工作，是十分必要的。根据国际发展方向，需要与国际标准接轨，加强研究规范性以及数据管理，为及时介入和利用药理学数据库作准备。,26,1）建立标准实验操作规程（SOP）：如果实验过程没有规范化管理，实验数据就无法统一，也无法用在数据库。因此，首先需要对每一个实验研究都建立符合国际通用或国家规范要求，并且可操作性强的SOP，并在研究中严格执行。这是建设数据库和实现信息交流的根本保证,27,2）制定数据库管理软件和格式,数据库参考国际标准，确定收集范围，制定统一格式，收集、存储符合SOP规范的原始数据和统计数据。根据数据库的要求，编制相应的合理、规范、使用方便的计算机软件。,28,总 之,面临21世纪的新挑战，亟需适应新形势，调整研究思路，针对主要技术难点，切实改进和创新包括神经药理在内的方法学。为适应神经系统创新性药物的研制开发，逐步建立和完善高通量药物筛选和神经功能综合评价技术平台，从源头发现先导化合物到评价候选药物，形成系统的研究体系。,29,