微生物实验课件全部.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,二、基本原理,取自不同来源的样品接种于平板培养基上，在,37,下培养,1,2,天，每一菌体即能通过繁殖形成一个可见的细胞群体的集落,菌落。,每一种细菌所形成的菌落都有其特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。,因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。,三、实验器材,培养基 肉膏蛋白胨琼脂平板,溶剂和试剂 无菌水,仪器和其他用具 灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。,2实验室细菌检查,（1）空气,将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。,1,标记,首先将器皿用记号笔做上记号，,培养皿的记号一般写在皿底上。,用记号笔写上班级、姓名、日期及样品来源。字尽量小些，写在皿底的一边。,（,e,）接种 按图,-2,在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（,图,-2,），立即闭合皿盖。并按,图,-2,将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。,（,f,）划线,另取接种环在火焰上灭菌，如图,-4,，先将环端烧热（,图,-4,，,1,），然后将接种环提起垂直放在火焰上（,图,-4,，,2,），以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次（,图,-4,，,3,）。,左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处（,图,-3,，,C,）。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。,闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环 通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按,图,-3,，,D,从上向下来回划线至,1,2,处。,烧灼接种环，转动平板，按,图,-3,，,E,，划最后,1,4,，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。,整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。,3,人体细菌的检查,（,1,）手指（洗手前与洗手后）,（,a,）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。,（,b,）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。,（,c,）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。,（,2,）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。,（,3,）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离口约,6,8cm,处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。,（,4,）鼻腔,（,a,）按照实验台检查法的步骤（,b,）和（,c,），取出棉签，并将其弄湿。,（,b,）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。,（,c,）按实验台检查法的步骤（,e,）和（,f,），接种与划线，然后盖上皿盖。,4,将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放,37培养箱，培养12天。,5,结果记录方法,（,1,）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后,1/4,面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数,1/4,面积的菌落数。,（,2,）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。,菌落特征描写方法如下：,（,a,）大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。,（,b,）颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。,（,c,）干湿情况 干燥、湿润、粘稠。,（,d,）形态 圆形、不规则等。,（,e,）高度扁平、隆起、凹下。,（,f,）透明程度 透明、半透明、不透明。,（,g,）边缘 整齐、不整齐。,五、实验报告,菌落观察,六、思考题,(1),列举,2,3,类微生物，说明他们在本实验条件下（肉膏蛋白胨琼脂平板，,37,）不能生长。,（,2,）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？为什么？,（,3,）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？,（,4,）比较洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？谈谈你的体会。,（,5,）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？你如何体会“为什么既是我们的朋友又是我们的敌人”。,实验二 细菌形态观察和染色实验,一、目的要求,学习微生物涂片、染色基本技术和无菌操作技术,;,初步掌握革兰氏染色法,;,巩固显微镜（油镜）的使用方法,;,初步认识细菌的形态特征。,二、,基本原理,革兰氏染色程序,结晶紫初染,碘液媒染,乙醇脱色,番红复染,最终结果,原理,革兰氏阳性菌,(G,+,),蓝紫色,蓝紫色,蓝紫色,蓝紫色,蓝紫色,细胞壁肽聚糖层呈网状，壁厚、类脂含量低，乙醇脱色时细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，透性降低，结晶紫,碘的复合物仍保留在细胞内,革兰氏阴性菌,(G,-,),蓝紫色,蓝紫色,无色,红色,红色,细胞壁肽聚糖层薄、类脂含量高，乙醇脱色时类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫,碘的复合物较易洗脱出来,三、器材,菌种,大肠杆菌,约,24h,营养琼脂斜面培养物，,金黄色葡萄球菌,约,24h,营养琼脂斜面培养物，,枯草芽孢杆菌,12,24h,营养琼脂斜面培养物。,染色剂 革兰氏染色液。,仪器或者其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等,涂片,涂成薄膜,干燥,自然干燥,固定,通过火焰,2,3,次,结晶紫初染,1-2min,碘液媒染,1min,乙醇脱色,至流出的乙醇无紫色,番红复染,2min,油镜镜检观察。,四、操作步骤,混合涂片涂色 按上述方法，在同一载玻片上，以,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌,或,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,作混合涂片、染色、镜检进行比较。,现场演示,1,载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚；,2,热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态；,3,染色时，每一步骤后都要立即水洗；,4,革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般,20,30S,。,注意：,五、实验报告,金黄色葡萄球菌,(G,+,),大肠杆菌,(G,-,),枯草芽孢杆菌,(G,+,),六、思考题,你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？,现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你利用大肠杆菌鉴定其革兰氏染色反应结果及其正确性。,热固定的目的是什么？,实验三 细菌的特殊染色技术,一、目的要求,学习并掌握芽孢染色法。,初步了解芽孢杆菌的形态特征。,学习并掌握荚膜染色法。,二、基本原理,用着色力强的染色剂孔雀绿，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，,进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，,再用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。,荚膜是包围在细菌胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于,荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。,所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。,三、器材,菌种,枯草芽孢杆菌约,2d,营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌约,2d,无氮培养基琼脂斜面培养物。,染色剂,5%,孔雀绿水溶液，,0.5%,番红水溶液，绘图墨水。,仪器和其他用具,小试管，滴管，烧杯，试管架，载玻片，盖玻片，滤纸，木夹子，显微镜等。,四、操作步骤,(1)SchaefferFulton,氏芽孢染色法,制片,常规涂片、干燥、固定。,染色,加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上,加热至染料冒蒸汽并开始计时，维持,5min,。,水洗,待玻片冷却后，用缓流自来水冲,洗，直至流出的水无色为止。,复染,用番红染液,复染,2min,。,水洗,用缓流水冲洗后，吸干。,镜检,油镜观察。,芽孢呈绿色，芽孢囊,及营养体为红色。,（,2,）荚膜的湿墨水染色法,制备菌和墨水混合液,加一滴墨水于洁净,的载玻片上，然后挑取少量菌,体与其混合均匀。,加盖玻片,将一洁净盖玻片盖在混合液,上，然后在盖玻片上放一张滤,纸，轻轻按压以吸去多余的混,合液。,镜检,用低倍镜和高倍镜观察，,背,景灰色，菌体较暗，在菌体,周围呈现明亮透明圈即为荚,膜。,注意：,1,芽孢孔雀绿染色加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂膜干涸。,2,芽孢染色水洗时，勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。,3,荚膜湿墨水染色时，加盖玻片勿留气泡，以免影响观察。,芽孢,荚膜,五、实验报告,1,芽孢染色结果 绘图表示枯草芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征）。,2,荚膜染色结果 绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。,六、思考题,用,SchaefferFulton,氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液？为什么？,若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养体细胞，你认为这是什么原因？,通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？,实验,四,微生物菌落制片技术,一、目的要求,1,学习并掌握放线菌形态的制片方法,2,学习并掌握霉菌的制片方法。,二、基本原理,放线菌插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。,霉菌载玻片培养法：无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。,这种方法既可以保持了霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。,三、器材,菌种,链霉菌；曲霉，青霉，根霉,培养基,马铃薯琼脂培养基,仪器或其他用具,灭菌平皿、载玻片、盖玻片、,U,形玻棒，接种环，解剖刀，镊子，,20%,的甘油，显微镜等。,四、操作步骤,1.,放线菌扦片法,倒平板,取融化并冷至约,50,的高氏,1,号,琼脂约,20mL,倒平板，凝固待用；,接 种,用接种环挑取菌种斜面培养物在琼,脂平板上划线接种。,插 片,以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻,片以大约,45,角插入琼脂内，插,片数量可根据需要而定。,培养 将插片平板倒置，,28,培养,3,5d,。,镜检 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面,培养物，将有菌的一面朝上放在载玻,片上，直接镜检。,注意,1,划线要细密些,以利插片；,2,插片要插在接种线上；,3,观察时,宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。,2 霉菌载玻片培养法,培养小室的灭菌,琼脂块的制作,取已灭菌的马铃薯培养基67mL注入另一灭菌的平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.51cm,2,的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块）。,接种,用尖细的接种针挑取少量的孢子接种于,琼脂块的边缘上，无菌操作用镊子将盖,玻片覆盖在琼脂块上。,培养,先在平皿的滤纸上加,3,5ml,灭菌的,20%,甘油，然后盖上皿盖，,28,培养。,镜检,根据需要可在不同的培养时间内取出载,玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。,注意,1,制作过程应注意无菌操作；,2,接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察；,3,观察时,宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。,五、实验报告,1,绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。,2,绘制曲霉、青霉、根霉的个体形态图，并注明各部位,名称。,3,简述,曲霉、青霉、根霉的菌落颜色及特征。,六、思考题,1,镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？,2,你主要根据哪些形态特征来区分上述三种霉菌？,3,根据载玻片培养观察方法的基本原理，你认为上述哪些过程中的哪些步骤可以根据具体情况作一些改进或可用其他的替代方法？,实验四 霉菌、放线菌的形态观察,一、目的要求,1,初步了解放线菌、霉菌的形态特征。,2,观察放线菌、霉菌菌落特征。,3,了解三类常见霉菌的基本形态特征。,二、基本原理,放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，常见放线菌大多形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫,基内菌丝,（简称“基丝”，,),，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出,气生菌丝,简称“气丝”,),，并进一步分化产生,孢子丝及孢子,。,在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，,气丝色暗，基丝较透明。,孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状,能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。,霉菌是可产生复杂分枝的菌丝体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段后分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。,霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）其孢子的形态特征是分类的重要依据。例如：,青霉的繁殖菌丝无顶囊，经多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，小梗上着生成串的青色分生孢子，孢子囊形如“扫帚”。,而曲霉的分生孢子梗顶端膨大成顶囊，成球形。,霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约,3,10um,），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍镜即可观察。,三、器材,菌种,链霉菌,培养基,灭菌的高氏,I,号琼脂,仪器或其他用具,经灭菌的：平皿、玻璃纸、盖玻片、玻璃涂棒以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，石炭酸复红染液，显微镜等。,1,、菌种：曲霉（,Aspergillus sp.,），青霉，根霉（,Rhizopus sp.,）和毛霉（,Mucor sp.,）培养,2,5d,的马铃薯琼脂平板培养物。,2,、溶液或试剂 乳酸石炭酸棉蓝染色液。,3,、仪器或其它用具 无菌吸管、平皿、载玻片、盖玻片、,U,形玻棒、解剖刀、镊子、,50%,乙醇、,20%,的甘油以接种针、显微镜等。,四、操作步骤,1.,插片法（,1,）倒平板 取融化并冷至大约,50,的 高氏,1,号琼脂约,20mL,倒平板，凝固待用。（,2,）接种 用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。划线要密些,以利插片。,（,3,）插片 以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约,45,。,角插入琼脂内（插在接种线上），插片数量可根据需要而定。,(4,）培养 将插片平板倒置，,28,培养，培养时间根据观察的目的而定，通常,3,5d,。,(5,）镜检 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。,观察时,宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察，如果用,0.1%,美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。,2,、载玻片培养观察法,（,1,）培养小室的灭菌 在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤片，再放一,U,形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于,121,灭菌,30min,，烘干备用。,（,2,）琼脂块的制作 取已灭菌的马铃薯（或察氏）琼脂培养物,6,7ml,注入另一灭菌的平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成,0.5,1cm,2,的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块）,制作过程应注意无菌操作。,（,3,）接种 用尖细的接种针挑取少量的孢子接种于琼脂块的边缘，无菌操作用镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。,（,4,）培养 先在平皿的滤纸上加,3,5ml,灭菌的,20%,甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，,28,培养。,（,5,）镜检 根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。,五、实验报告,1,结果 绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。,2,绘图示青霉、黑曲霉的分生孢子梗、分生孢子实验结果,(1),曲霉、青霉、根霉的菌落颜色及特征。,(2),绘制曲霉、青霉、根霉的个体形态图，并注明各部位名称。,六、思考题,（,l,）试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。（,2,）玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类群微生物的培养和观察？为什么？（,3,）镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？,（,1,）你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？,（,2,）根据载玻片培养观察方法的基本原理，你认为上述哪些过程中的哪些步骤可以根据具体情况作一些改进或可用其他的替代方法？,（,3,）你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？,实验六 微生物显微镜直接计数法,一、目的要求,1,明确显微镜计数的原理。,2,学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。,二、基本原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。,将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（,0.1mm,3,），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。,由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。,血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。,计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成,16,个中方格，而每个中方格又分成,25,个小方格，共,400,小格；,另一种是一个大方格分成,25,个中方格，而每个中方格又分成,16,个小方格，总共也是,400,小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。,每一个大方格边长为,1mm,，则每一大方格的面积为,1mm,2,，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为,0.1mm,，所以计数室的容积为,0.1mm,3,。其计算方法如下：,1,1625,计数板计算公式,细胞数,/ml=(100,小格内的细胞数,/100)4001000,稀释倍数,2,2516,计数板计算公式,细胞数,/ml=(80,小格内的细胞数,/80)4001000,稀释倍数,三、器材,菌种：酵母菌悬液,仪器或其他用具：血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。,四、操作步骤,1,菌悬液制备,以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。,2,镜检计数室,在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。,3,加样品,将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液体；加样时计数室不可有气泡产生。静置,510,分钟即可计数。,4,显微镜计数,将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有,510,个菌体为宜。,若选用,2516,规格的计数板则每个计数室选,5,个中方格，可选,4,个角和中央的中格（即,80,个小格），,若选用,1625,规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即,100,小格）中的菌体进行计数。,位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。,如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。,显微镜及显微镜下的微生物,5,清洗血球计数板,使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。,五、实验报告,各中格中菌数,A,B,菌数,/ml,二室,平均数,1,2,3,4,5,第一室,第二室,六、思考题,（,1,）为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？,（,2,）根据你的体会，说明用血细胞技术的误差 主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？,（,3,）某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计,1,2,种可行的检测方法。,一、目的和要求,1,观察酵母菌的出芽繁殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。,2,掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。,实验七 酵母菌细胞的形态观察、死活细胞的鉴别,二、基本原理,1,形态观察：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，通常比常见细胞大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。,2,死活鉴定：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型呈无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，,由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。,因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则成蓝色或淡蓝色。,三、器材,1,、染液：吕氏碱性美蓝染液,2,、菌种：酿酒酵母的斜面培养物,3,、仪器和其他用具：显微镜、载玻片、盖玻片等,四、操作步骤,1,、美蓝浸片的观察：,1,）在载玻片中央加一滴,0.1%,吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。,染液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片时菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。,2,）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。,盖玻片不宜平放着放下，以免产生气泡影响观察。,3,）将制片放置约,3min,后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并据颜色来区别死活细胞。,4,）染色约,0.5h,后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。,5,）用,0.05%,吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。,2,、水,-,碘液浸片的观察,在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加三滴水，取少量酵母菌苔放在水,-,碘液中混匀，盖上盖玻片镜检。,五、实验报告,1,、绘图说明所观察的酵母菌的形态特征。,酵母死活细胞的对比,六、思考题,（,1,）吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。,（,2,）在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？,一、目的要求,1,、明确培养基的配制原理。,2,、掌握配制培养基的一般方法和步骤。,3,、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围,实验九 培养基的配制及灭菌,二、基本原理,培养基的组成,C,源，,N,源，无机盐，生长因子，水,培养基的类型,天然培养基，合成培养基，半合成培养基,液体培养基，固体培养基，半固体培养基,细菌培养基，真菌培养基等,基本培养基，选择培养基等,二、基本原理,牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和,NaCl,。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而,NaCl,提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下,96,时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在,40,时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。,由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其,pH,调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。,牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：,牛肉膏,3g,蛋白胨,10g NaCl 5g,琼脂,1520g,水,1000ml,pH 7,47,6,高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于,100,的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为,200300nm,的紫外线都有杀菌能力，其中以,260nm,的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了,DNA,的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成,O,，再使,O2,氧化生成臭氧（,O3,）或使水（,H2O,）氧化生成过氧化氢（,H2O2,），,O3,和,H2O2,均有杀菌作用。,紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过,1,2m,为宜。,此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内）喷洒,35,的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面，凳子可用,23,的来苏尔擦洗，然后再开紫外线灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。,三、器材,马铃薯，琼脂；,1mol/L NaOH,，,1mol/L HCl,；,试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，,pH,试纸（,pH 5,59,0,），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。,四、操作步骤,1,称量,按培养基配方比例依次准确地称取药品。,注意，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。,2,溶化,在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。,如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。,3,调,pH,在未调,pH,前，先用精密,pH,试纸测量培养基的原始,pH,值，如果,pH,偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入,1mol/L NaOH,，边加边搅拌，并随时用,pH,试纸测其,pH,值，直至,pH,达,7,6,。反之，则用,1mol/L HCl,进行调节。注意,pH,值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。,对于有些要求,pH,值较精确的微生物，其,pH,的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。,4,过滤,趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。,5,分装,按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图,-1,。,分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。,(1),液体分装分装高度以试管高度的,1/4,左右为宜。,(2),固体分装分装试管，其装量不超过管高的,1/5,，灭菌后制成斜面，如图,-2,。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。,(3),半固体分装试管一般以试管高度的,1/3,为宜，灭菌后垂直待凝。,6,加塞,培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。,7,包扎,加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。,8,灭菌,将上述培养基以,1.05kg/cm2,（,15,磅,/,英寸,2,），,121,3,，,20,分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。,9,搁置斜面,将灭菌的试管培养基冷至,50,左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。,10,无菌检查,将灭菌的培养基放入,37,的温室中培养,2448,小时，以检查灭菌是否彻底。附：棉塞的制作 棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状、大小、松紧与试管口（或三角烧瓶口）完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的,1/3,在试管口外，,2/3,在试管口内，如图,-3,。棉塞的制作过程如图,-4,。,此外，在微生物实验和科研中，常要用通气塞。所谓通气塞，就是几层纱布（一般为,8,层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好通气促使菌体的生长或发酵。通气塞的形状如图,-5,。,五、实验报告,结果,检查培养基灭菌是否彻底。试管清洁如何，培养基制备的合不合理。,六、思考题,（,1,）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？,（,2,）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？图,5,通气塞,A,配制时纱布塞法；,B,灭菌时包牛皮纸；,C,培养时纱布翻出,（,3,）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？,（,4,）干热灭菌完毕后，在什么情况下才能开箱取物？为什么？,（,5,）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到,0,时才能打开排气阀，开盖取物？,紫外线杀菌的原理是什么？,P20,、,27,