微生物的育种与菌种保藏.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 遗传物质的物质基础,第二节 菌种的衰退、复壮和保藏,讲课内容,遗传,(heredity),：,亲代生物传递给子代一套实现与其相同性状的遗传信息。,特点：具稳定性,遗传型（,genotype,）：,又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和。,是一种内在可能性或潜力,表型（phenotype）：,指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;,是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,遗传型,+,环境条件 表型,可能性,现实性,饰变（modification）：,指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,特点：,a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；,b.性状变化的幅度小；,c.,因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,一、3 个经典实验,（一）经典转化实验,（二）噬菌体感染实验,（三）植物病毒重建实验,1928年 F.Griffith 肺炎链球菌,使小鼠患败血症死亡,S型菌株-菌株形成荚膜、菌落表面光滑、致病,R型菌株-菌株不形成荚膜、菌落表面粗糙、不致病,（一）经典转化实验,（二）噬菌体感染实验,（三）植物病毒的重建实验,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变,一、基因突变,突变：指生物体的遗传物质的分子结构发生的可遗传的变化。,狭义突变：基因突变,点突变,广义突变：基因突变和染色体畸变,突变的几率：,10,-6,-10,-9,野生菌株 -突变-突变株,(一)基因突变类型(表型分类),选择性突变,非选择型突变,营养缺陷型(株),抗性突变型(株),条件致死突变(株),形态突变型(株),抗原突变型(株),产量突变型(株),营养缺陷型因突变而丧失合成某种物质的能力，因此必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。,抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的突变株。,条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型,抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变,(二)突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。,突变率为,10,8,是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。,突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（,mutant,，即突变型）的数目来表示。,10,8,210,8,突变率,=,突变细胞数,/,分裂前群体细胞数,突变是独立的：某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。,（三）基因突变的特点,以细菌的抗药性为例,稀有性：突变率低且稳定 (10,-6,-10,-9,),可诱发性：诱变剂可提高突变率,稳定性：变异性状稳定可遗传,基因突变的特点,独立性：,各种突变独立发生，不会互相影响。,可逆性：,从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变。,不对应性：,突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。,自发性：,突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。,1、变量实验,2、涂布实验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,初始接种量：510,4,个/皿，培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5 100个细菌；这时，每个平皿上的细胞数为：5100510,4,2.6 10,8,个/皿,在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：,6(2.6 10,8,5 10,4,)=15.6 10,8,；,在未涂布的平板上共发现28个突变；,故 突变率=28/15.6 10,8,=1.8 10,8,3、影印平板培养法,1952,年，,J.Lederberg,夫妇的论文,平板影印培养法和细菌突变株的间接选择,，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。,在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，,充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用,。,平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种实践和其它研究中均有应用。,(五)基因突变机制,自发突变,诱发突变,1、染色体数目的变化,整倍变化：n-2n-3n-4n,非整倍变化：n-,n+1-,n-1,2n-2n+1-,2n-1-,2n-2,2、染色体结构的变化,染色体结构的变化也称为染色体畸变，包括：缺失、重复、倒位、易位、转座。,转座因子（可移动基因、跳跃基因）,一般认为这是由于染色体单体发生断裂后，错误性愈合而造成的。,可造成隐性基因的表达、显形基因的拷贝数增多、某一性状的缺失、基因间连锁程度的变化、不同染色体基因的连锁等变化。,3、基因突变(点突变)的诱变机制,代表性的诱变剂的作用机制。,种类：诱变剂的种类很多；,诱变剂,(mutagen)：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂；,(,1)碱基置换(Substitution),转换(transition)，,即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换,一对碱基被另一对碱基所置换,颠换(transversion)，,即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,双链DNA,单链DNA,碱基置换后会出现下列几种情况,(2)无义突变:氨基酸的碱基置换后变成不完整的蛋白。如：,UGA（乳石突变）,等终止密码子。,(1)错义突变:一种氨基酸，变成另一种氨基酸；,(3)同义突变:碱基发生了置换，但由于遗传密码子的简并性，氨基酸不变。如密码子GCU置换成GCC后，它们都是丙氨酸的密码子；,(4)沉默突变：碱基置换造成多肽链中一个氨基酸的改变，但该氨基酸对蛋白质的结构和功能没有多大的影响，并没引起细胞表型变化。,A.直接引起置换的诱变剂,一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。,例如：亚硝酸、羟胺和各种烷化剂,作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步(最终结果)使微生物发生变异。,羟胺只引起GCA:T,其余都是可使GC=A:T互变的。,能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。,*亚硝酸,HNO,2,胞嘧啶(C),尿嘧啶（U）,HNO,2,腺嘌呤(A),次黄嘌呤(,H),鸟嘌呤,(G),黄嘌呤(X),HNO,2,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（,He）,He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）,DNA,复制时，,HK,与胞嘧啶（,C,）配对,DNA,第二次复制时，,C,与,G,正常配对，实现了转换。,(六)紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多，嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物;,其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。,紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的,胸腺嘧啶二聚体;,1、光复活作用(photoreactivation),经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。,经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的,DNA,分子，在黑暗下会被一种光激活酶即光裂合酶,(,photolyase,),结合，当形成的复合物暴露在可见光,(400500nm),下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。光激活酶也从复合物中释放出来。每一,E.coli,细胞中约含有,25,个光激活酶分子,。,由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。,2、暗修复作用(dark repair),又称切除修复,(excision repair),。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂,(,包括烷化剂、,X,射线和,射线等,),损伤后的,DNA,的机制，这种修复作用与光无关。,有四种酶参与：,内切核酸酶：切开；,外切核酸酶,：扩大；,DNA,聚合酶：复制；,通过,连接酶：连接；,完成了修复作用。,切除修复(excision repair),3、紫外诱变方法,设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等,;,紫外灯：波长为,253.7 nm,功率是,15 W;,处理时的照射距离：,20cm 30cm;,样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过,3 mm;,照射时，要用磁力搅拌器搅拌,;,处理剂量：常用照射时间或杀菌率作为相对剂量,;,生产上经常采用的剂量：死亡率为,70%80%,左右。,在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠,;,通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量,;,二、突变与育种,(一)自发突变与育种,1、生产中育种,10,-6,突变率-寻找正向突变菌株,2、定向培育优良菌种 牛型结核杆菌-13年-230代-卡介苗(减毒活菌疫苗),（二）诱变育种,诱变 +筛选,诱变是随机的；筛选是定向的，目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。,1、诱变育种的基本规律,第二节 菌种的衰退、复壮和保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行,影响微生物菌种稳定性的因素：,1.,变异,;2.,污染,;3.,死亡。,一、菌种的衰退与复壮,衰退：(degeneration)：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。,菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变、环境条件导致菌种的变异。,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,衰退菌种,常见的衰退现象,菌落和细胞形态的改变;,生长速度缓慢，产孢子越来越少;,抵抗力、抗不良环境能力减弱等。,代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降;,菌种的复壮,(rejuvenation),1.狭义的复壮:,从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。,纯种分离；通过寄主体进行复壮(杀螟杆菌,菜青虫)；淘汰已衰退的个体。,2.广义的复壮：,有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,定义：使衰退的菌种恢复原来优良性状,。,二、防止衰退的措施,5.采用有效的菌种保藏方法。,3.经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查;,2.创造良好的培养条件;,1.减少传代次数;,4.利用不同类型的细胞进行接种传代(构巢曲霉分生孢子,子囊孢子)；,三、菌种保藏,目的：,在一定时间内使菌种存活、不死、不变、不污染；,防止优良性状丧失；,随时为生产、科研提供优良菌种。,菌种保藏,基本原则：,2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体;,3、创造有利于休眠的保藏环境(如干燥、低温),4、尽可能多的，采用不同的手段，保藏一些比较重要的微生物菌株;,1、挑选典型菌种的优良纯种;,菌种保藏,原理,：,首先选用优良的纯种，最好是休眠体，(如分生孢子、芽胞等),其次创造长期降低微生物代谢强度，难以发生突变的环境条件。(其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等),基本方法,培养基传代培养(斜面、平板),寄主传代培养,低温(液氮、低温冰箱),干燥(沙土管、真空干燥),生活态,休眠态,7 种常用菌种保藏方法的比较,冷冻干燥保藏法和液氮保藏法,三、菌种保藏机构,5.荷兰的霉菌中心保藏所(CBS),4.日本大阪的发酵研究所(IFO)，Osaka,3.英国的国家典型菌种保藏所(NCTC),2.美国典型菌种保藏中心(ATCC),1.中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCCC),