基因工程-第9章-外源基因的表达1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因表达(gene expression)就是指某一基因指导下的蛋白质合成，蛋白质是基因表达的产物。,克隆基因表达方面的研究成果，对于某些研究领域有着重要的用途。首先，它有可能为揭示蛋白质结构与功能之间的关系提供新的研究手段。例如，运用重组DNA技术，能够获得可在大肠杆菌细胞中进行有效表达的杂种干扰素的编码基因。这样，便可以将这种蛋白质分子纯化出来，在体外进行生物学方面的研究。,利用基因工程技术将真核基因转至原核生物中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用传统和常规方法不能或难以大量生产的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产就方便得多。例如生长激素释放抑制因子从50万只羊脑中仅能提取出5mg，而现在用10L的工程菌液即能提出来。用720kg猪胰脏只能够提取出100mg胰岛素，而用2000L工程菌发酵液即可得到同样量的胰岛素。从这些例子中可以看到基因工程在应用方面的巨大潜力。,9.1 外源基因在原核细胞中的表达,9.1.1 原核生物基因表达的特点,同所有的生命过程一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程：即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。与真核细胞相比，原核细胞的表达有以下特点：,原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。,原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动子(promotor)及其他有调控功能的部位。,9.1.2 基因表达的调控序列,如上所述，由于原核和真核细胞中基因表达的机制是不同的，因此必须详细了解基因表达过程中的各种调控因子，构建高效的表达载体，才能达到高效率、高水平表达外源基因的目的。对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。,1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。,原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。,Pribnow盒，位于转录起始位点上游510bp，一般由68个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。,-35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为，-35区是RNA聚合酶,亚基的识别与结合位点。当,亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶的核心酶(core enzyme，无,亚基的RNA聚合酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒，并与之接触，而一旦它们相互结合之后，,亚基就从最左边的识别位点上解离下来。,(1)lac启动子 lac启动子是来自大肠杆菌的乳糖操纵子。lac操纵子模型最初由Jacob和Monod于1961年提出，它是DNA分子上一段有方向的核苷酸顺序，即由阻遏蛋白基因，(lac I)、启动基因(启动子P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成(图8-2)。,(2)trp启动子 trp启动子可从大肠杆菌的色氨酸操纵子中分离。色氨酸操纵子结构基因排列及其表达如图8-3所示。,(3)P,L,和P,R,启动子 P,L,和P,R,启动子是指从,噬菌体中得到的一类启动子，它比lac启动子活性高8-10倍。,噬菌体有自己的一套阻遏物-操纵基因系统(图8-4)。,(4)tac启动子 tac启动子是一组由非常强的trp和lac启动子人工构建的杂合启动子。它比lac UV5启动子强7倍。其中tac I是由trp启动子的-35和lac UV5的-10区构成；tac是由trp启动子的-35区加上一个合成的46bpDNA片段(包括Pribnow盒区)和lac基因所构成；tacl2是由trp的-35区和lac的-10区，再加上lac操纵子中的操纵基因部分和S-D序列融合而成的，它受1ac阻遏蛋白的负调控，并被IPTG诱导。,2S-D序列,mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。1974年Shine和Dalgarno首先发现，,在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3-10 bp处的由3-9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列,。,3终止子,在一个基因的3端或是一个操纵子的3端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停留在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上；完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来；RNA聚合酶从模板上释放出来。对RNA聚合酶起终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含GC的区域，GC富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且具有与A/T富含区对应的一串U。,4衰减子,衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。,在原核生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽链合成的起始点，同RNA分子的5-P末端间的距离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前的不转译的mRNA区段，叫做前导序列(1eader)。此外，在mRNA的3-OH末端，以及在多顺反子mRNA中含有的长达数百个碱基的顺反子间序列(intercistranic-sequence)，即间隔序列(spacer)，也发现有不转译的序列。,9.1.3 几种类型的原核表达载体,非融合蛋白：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为,非融合蛋白,。,非融合蛋白的优点在于它具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。,非融合蛋白的最大缺点是容易被细菌蛋白酶所破坏。,融合蛋白：融合蛋白是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为,融合蛋白,。含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。,基因工程的载体有克隆载体和表达载体之分。克隆载体中都有一个松弛型复制子，能带动外源基因在受体细胞中复制扩增。表达载体是适合在受体细胞中表达外源基因的载体。,1.非融合型表达蛋白载体pKK223-3,这个载体是由Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的。在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源基因。它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动于是由trp启动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列组成。在lac I宿主(如JMl05)，tac启动子受阻遏，但只要在适当的时候加上IPTG，就可去阻遏。如图8-7所示，紧接tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头(polylinker)，使之很容易把目的基因定位在启动子和S-D序列后。在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子，目的是为了稳定载体系统。因为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终 止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性有关的基因 表达。,2.分泌型克隆表达载体pIN 系统,这个载体系统是以pBR322为基础构建的。它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂蛋白基因)启动子。在启动子的下游装有lac UV5的启动子及其操纵基因，并且把lac阻遏子的基因（lac I）也克隆在这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始顺序(S-D序列及ATG)。,3.融合蛋白表达载体pGEX系统,pGEX系统由Pharmacia公司构建，由3种载体pGEX-l,T，pGEX-2T和pGEX-3X以及一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B组成。载体的组成成分基本上与其他表达载体相似，含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lac I阻遏蛋白基因等。,这个载体系统具有以下优点：可诱导高效表达；载体内含有lac I阻遏蛋白基因；表达的融合蛋白纯化方便；使用凝血酶(thrombin)和Xa因子(factor Xa)就可从表达的融合蛋白中切下所需的蛋白质和多肽；用,Eco,R I从,gt11载体中分离的基因可直接插入pGEX-l,T中(图8-9)。,9.1.4 提高克隆基因表达效率的途径,1.启动子结构对表达效率的影响,研究人员通过对大量的大肠杆菌启动子序列分析后发现，它们都有两种保守序列，又称为一致序列(consensus sequence)，即-35区的5-TTGACA序列和-10区的5-TATAAT序列(Pribnow盒)。但是值得注意的是，,在表达载体中广泛使用的4个启动子，没有一个表现出与一致序列完全相同。但启动子的强弱与它们的一致序列相似的程度成正比。,进一步的研究表明，-35和-10区之间的距离也是一个重要因素。如果,间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于17个碱基对，启动子表现较弱,。,2.转译起始序列对表达效率的影响,在mRNA转译序列中除了起始密码子AUG之外，至少还有3种特征性的保守结构。第一种，也是最重要的一种是S-D序列，它含有多聚嘌呤序列,5UAAGGAGGU3,的全部或其中的一部分；第二种(至少在多顺反子的mRNA分子中可以见到)是在核糖体的结合位点有一个或数个终止密码子；第三种，编码诸如噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白质的基因，它们的核糖体结合位点含有全部的或部分的PuPuUUUPuPu序列。,实验证明，,连接在S-D序列后面的4个碱基成分的改变会对转译效率发生很大的影响,。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50或25。,直接位于,起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样也会对转译的效率发生影响。,以,-,半乳糖苷酶mRNA的转译为例，当这个三联体碱基组分是UAU或CUU时，其转译最为有效，而如果是UUC，UCA或AGG代替了UAU或CUU，那么它的转译水平将下降20倍。,3.启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响,启动子与结构基因间的距离在蛋白质翻译上有巨大作用。进一步的研究表明：翻译的起始点和S-D序列必须接近到一定程度；翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA 5末端区域间的互作，这时mRNA的5末端已折叠成特殊的 二级结构。,4.转录终止区对克隆基因表达效率的影响,在克隆基因的末端，存在一个转录终止区是十分重要的。其原因是：第一，若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质；第二，在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了转译的效率；第三，偶然会出现启动子阻塞现象promoter occlusion)，也就是说，克隆基因启动子所开始的转录，会干扰另一个必要的基因或调节基因的转译。而转录终止区的存在，可使上述这几种不利的现象得以避免。所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基因的表达效率)控制在一个正常的水平上,5.质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响,限制蛋白质合成的第一步，是发生在核糖体同mRNA分子结合的过程中的。由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是大大超量的，因此，,提高克隆基因表达效率的途径之一是增加相应的mRNA分子的数量,。怎样才能达到这样的目的呢?影响mRNA分子合成速率的因素有两种：第一种是启动子的强度，这在前面已经作了讨论；第二种是基因的拷贝数。提高基因的拷贝数(即基因的剂量)最简单的办法是，,将基因克隆到高拷贝数的质粒载体上,。,6.提高翻译水平常用的途径,(1)调整S-D序列与AUG间的距离,(2)用点突变的方法改变某些碱基,(3)增加mRNA的稳定性,7减轻细胞的代谢负荷,(1)诱导表达,(2)表达载体的诱导复制,8.提高表达蛋白的稳定性，防止其降解,(1)克隆一段原核序列，表达融合蛋白,(2)采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解,(3)表达分泌蛋白,大肠杆菌主要由4部分组成：胞质、内膜、外膜及内外膜之间的周间质。一般情况下，所谓“分泌”是指蛋白质从胞质跨过内膜进入周间质这一过程。而蛋白质从胞质跨过内、外膜进培养液这种情况较为少见，被称为“外排”以区别于“分泌。,