--BT第2讲基因工程第1讲-概论ppt课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,第二章,基因工程,（,Gene engineering,）,1,.,概 论,2,.,要 求,1、,掌握,基因工程的概念,2、,掌握,基因工程的基本过程,3、,熟悉,工具酶和载体类型及应用,4、,熟悉,原核、真核细胞转染、表 达的基本方法和类型。5、,熟悉,基因工程产生的基础和过程 (科研思维与方法）。,6.设计一个基因克隆的程序,。,3,.,参考书,楚雍烈，现代生物技术（西安交通大学讲义）,Gene cloning,T.A.Brown.,基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社,基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社,分子克隆实验指南，J.Sambtook,EF Frish,T Maniatis,金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。,4,.,生物技术的核心内容,基因工程,（Gene engineering）,DNA重组（recombinant DNA,technology）,基因操作（gene manipulation）,基因克隆（gene cloning）,分子克隆（molecular cloning）,DNA克隆（DNA cloning）,基因修饰（gene modification）,5,.,基因工程的概念,基因工程的意义,基因工程的发展史,理论上的六大发现,技术上的六大进展,发展过程中的重大事件,基本步骤:两个水平，六个阶段,内容提要,6,.,一、基因工程的概念,定义：,人们按照,预定设计,，在,体外,对,不同来源DNA,分子进行人工切割、连接、插入载体DNA分子，使遗传物质,重新组合、改造,，,经,转移,、,导入到原先不含有重组体的,受体细胞,，,使之持续稳定繁殖、目的基因扩增、表达，获得人类所需的,产品,的工程。,7,.,With Restriction enzymes,With Restriction enzymes,with DNA ligase enzyme,(Genetic transformation),8,.,基因工程的基本内涵,基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。,因此，,供体、受体、载体,是重组DNA技术的三大基本元件。,体外重建、基因转移,和,外源表达,是重组DNA技术的三大环节。,9,.,基因工程的基本特征,基因工程有两个重要的特征：,一是可把来自,任何,生物的,基因,重组,和,转移,到与其毫无关系的,任何,其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；,二是某一段DNA可在受体细胞内进行,基因复制,和,表达,，,为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。,10,.,基因工程的目的,（1）获得目的基因，DNA的提取、纯化和 DNA分子的克隆，,建立文库,。,（2）制备活性多肽产品：激素、细胞因 子、多肽药物疫苗等，,诊断和防治 疾病,。,（3）研究,基因结构、功能,等,11,.,二、基因工程的重大意义,（1）重组DNA技术填平了生物种属间 不可逾越的鸿沟。,跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。,12,.,（2）重组DNA技术缩短了进化时间。,遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在漫漫历史长河中，自然变异的进化时间是千万年，常规育种亦要几年；而重组DNA技术将进化时间大大缩短至几年。基因操作用于育种，将缩短进化时间，在解决全世界人民温饱问题上将发挥重要作用。,13,.,（3）重组DNA技术使人类能对生物 进行定向改造,重组DNA技术标志着人类控制和改造生物的历史已进入一个新纪元。以重组DNA技术培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组分之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜抗真菌感染具有重要意义。,14,.,（4）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。,15,.,（5）医学上应用更为广泛，涉及各领域,正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因 的查明、诊断、治疗和预防。药物的研发和生产；疾病模型的建立；人类的营养、健康、长寿和保健,（亚健康）,16,.,17,.,本课程的地位：,现代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,18,.,基因工程不是发现，而是创造。,19,.,改变传统农业概念,让植物生产人体蛋白质,生产促性腺绒毛激素的矮牵牛,20,.,发光的水稻,21,.,只 有 想 不 到 的,没 有 办 不 到 的,基因重组,22,.,第一节,基因工程的,发生与发展,23,.,一、基因工程诞生的理论基础,20世纪中期分子遗传学理论的重大进展,六大发现,：,1确定了生物,遗传的物质基础,是DNA,肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验,噬菌体DNA转化实验,24,.,1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。,25,.,2,DNA分子,双螺旋结构,模型,和,半保留复制,DNA碱基配对规律和X衍射研究,DNA双螺旋结构模型。,26,.,27,.,3生物遗传的,“中心法则”,解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。,自我复制，遗传信息由亲代传给子代；,通过转录，遗传信息传给RNA；,通过翻译，信息传给蛋白质和酶；,基因型决定生物的表型。,DNA,RNA,protein,28,.,Replication,Replication,Transcription,Reverse Transcription,Translation,中心法则,（the central dogma）,29,.,30,.,4,“操纵子”,学说揭示了基因表达 和调控的概念。,基因组结构 基因分布 基因表达 基因调控的原理 酶诱导的本质,31,.,5破译了全部生物,遗传密码,，,确定了它在生物界的通用 性，人类更加具体地了解 遗传信息表达规律。,32,.,遗传密码表,目 录,33,.,mRNA分子上从5,至3,的,方向,每3个核苷酸构建一个密码子，编码某一特定氨基酸或作为蛋白质合成的起始、终止信号，称为,三联体密码(triplet codon)，也称遗传密码子(genetic codon)。,解决了信息语言的对应关系。,34,.,终止密码,：,翻译终止的密码，不代表任何氨基酸。有3个：,UAA、UAG、UGA,代表氨基酸的密码,：,64 3=,61,起始密码：,AUG,在mRNA起始部位时为起始密码。否，为Met密码。,密码,:,4,3,=64,35,.,1)通用性,遗传密码具有的特点,从原核生物到人类都使用同一套遗传密码。,已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,2)方向性,mRNA,分子上由起始密码,AUG,开始，从,5,3,方向阅读密码子，直至终止密码。,决定蛋白质分子从,N,端,C,端的排列顺序。,36,.,3)连续性,三联体密码连续性表现为中间无标点，连续阅读。,mRNA,开放阅读框架内发生一个或两个碱基插入或缺失，可引起,移码突变,(,frameshift,mutation),。,37,.,4)简并性,目 录,即有多个密码子特异地破译同一个氨基酸,遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅对应一个密码子外，其余氨基酸均有一个以上密码子为其编码。,38,.,5)摆动性,tRNA上反密码子的,第1位,碱基与mRNA密码子的,第3位,碱基配对时，可以在一定范围内变动，即,并不严格遵循碱基配对,规律，这一现象称为,摆动性,。,39,.,6、,生物进化，基因突变、,获得的性状可以,遗传到,后代。,40,.,分子遗传学理论上的六大进展解决了,生命现象的遗传物质基础（均是核酸）,结构模型（同类构件、双螺旋）,复制方式（相似的机制）,遗传信息流动方向（共同的中心法则）,遗传密码（共用一套相同的密码）,表达和调控的机理（类同的方法）,基因突变机理、意义（变异与进化）,为基因工程技术的诞生典定了理论基础,。,理论上的可行性。,41,.,二、分子遗传学新方法是基因工程的,技术基础,（,六大技术,）,首当其冲的是要解决：,如何自如地得到目的基因；,如何在体外改造基因，得到重组体；,如何在体外转移重组基因；,直到20世纪70年代中期，相继出现了,几项关键性技术，梦想成真。,42,.,1工具酶的发现,：,DNA分子的切割和连接技术,1970年Smith发现了第一个型限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease，RE)Hinf,对DNA分,子有特异地切割作用。,（手术刀剪）,同年Khorana又发现了T4DNA连接酶（Ligase），,能将DNA片段连接在一起。,（缝纫机、浆糊）,DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶,。,（复印机）,构成了一个研究DNA、RNA分子的,工具酶箱,。,43,.,2、DNA片段,载体系统,的构建,目的基因、DNA片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的DNA分子上。,载体（vector),是能携带外源DNA、能自我复制的小DNA分子。,最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。,44,.,3、大肠杆菌,受体细胞系统,建立,体外获得的含目的基因或DNA片段的重组体，虽具有自我复制的本能，但没有原料、酶系统和生命活力。必须将其安全转移到宿主细胞才能进行增殖，赋予其“生命”。,45,.,4、大肠杆菌DNA,转化体系,建立,1970年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源DNA；,1972年Cohen C报道，质粒DNA也能被大肠杆菌吸收。,而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的DNA片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。,46,.,5、DNA,分析、鉴定,技术,酶切分析技术（核酸,分辨,仪）,核酸分子杂交技术（核酸,探测,仪）,序列分析（密码,复读,机）,生物信息学（,密码,破译,机）,47,.,6、DNA,分离、纯化及鉴定,技术,凝胶电泳：Agarose,PAGE gel,离心技术,层析技术,印迹技术:Southern blot,.,48,.,技术上的,可行性,六大技术方法的建立,实际上的,可操作性,材料、实验条件、时空条件、经济条件和政策。,基础方面的基本条件（,可能性+可行性+可操作性,）具备，尚需人的科学,创新思维+艰苦的实践,。,才能得到创新的发明、发现 和成果。,49,.,1970年，MIT 的科学家率先提出在体外把不同来源的遗传物质进行重组的设想，但遭到反对，不予支持。没能进行试验。,1972年，Boyer等在发现限制性核酸内切酶EcoR I 的基础上，开始了实验。,50,.,1972年Berg等人使用EcoRI在体外对,猴病毒SV40,的DNA和,噬菌体,的DNA分别酶消化，再用T,4,DNA连接酶将两种片段连接起来，得到,SV40和 DNA的重组杂种DNA分子,，,率先完成了世界上第一次成功的DNA体外,不同物种之间,的DNA重组实验（片段重组）。,基因工程的大胆尝试,51,.,基因工程的诞生,1980年Nobel化学奖,1972,年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验。,Berg的开创性实验,52,.,1973,年 Cohen 成功地进行了另一个体外DNA重组实验。,分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组的DNA分子转化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。,他的工作是世界上第一次成功的,基因克隆,实验，并有基因表达及新的表型,。,标志着基因工程的诞生。,53,.,pSC101,pR,6-5,抗四环素,抗卡那霉素,EcoRI,抗卡那霉素基因,DNA连接酶,重组DNA分子,54,.,培养平皿,四环素平板,卡那霉素基因,四环素卡那霉素基因,大肠杆菌,55,.,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因表达实验。,56,.,1974年，,首次实现异源间基因重组。把小鼠的生长激素抑素基因在大肠杆菌中表达。,57,.,1976年，,世界上第一个基因公司在美国成立，“Genetech”注册登记，意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。生物工程从此进入产业化。,58,.,1978年,，,人类的第一个基因被克隆。人生长激素抑素基因被重组到大肠杆菌的质粒DNA中。,1978-1979,胰岛素基因在大肠杆菌中表达。,59,.,1982,年,1,、把大白鼠的生长激素基因克隆、转移到小鼠的受精卵内，第一个转基因超级鼠诞生。,2,、人胰岛素基因的,cDNA,被克隆、成功表达和开始成为商品上市。,基因产品有效益、开始新兴产业。,60,.,三、基因工程的基本步骤,两个水平，六个阶段,61,.,基因工程包括分子和细胞两个水平操作,分子水平操作指的是基因重组、克隆和表达的设计与重组体构建（即重组DNA技术）；,细胞水平操作则指转化、筛选和培养工程菌或细胞以及表达产物的分离纯化过程。,62,.,1分子水平操作阶段：,获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子）。,本阶段的操作有三个主要环节：,（1）,分,离：提取、分离含目的基因的DNA分子和载体DNA分子，在分离提取过程中，注意质、量，减少损伤。（2）,切,割：选择合适的RE工具酶，分别对外源目的DNA分子和载体DNA分子进行酶解切割。（3）,连,接：用DNA连接酶，将目的基因与载体在体外连接为一个重组DNA分子，并进行鉴定。,63,.,分离：,目的基因的获取,需要克隆的DNA片段：,化学合成法,cDNA文库,基因组DNA文库,聚合酶链式反应,64,.,载体DNA的选择,功能,：,为目的基因提供进入受体细胞的,转移,能力。,为目的基因提供在受体细胞中,复制,或,整合,能力。,为目的基因提供在受体细胞中的,表达,能力。,65,.,限制性内切,酶酶切,切割：,内切酶,连接酶,连接：,DNA连接酶,66,.,2.细胞水平操作阶段：,把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细 胞，赋予其“生命”让其表达，获得产品。,本阶段的操作也有三个主要环节。,（1）,转,移：利用DNA转移技术，把构建的重组体导入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞,。（2）,筛,选：利用核酸杂交，酶切分析、PCR和表型特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌/细胞。,（3）,表,达：大量培养含重组体的工程菌/细胞，诱导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。,67,.,重组体的转化,受体细胞,转移：,含氨苄平板,重组质粒,感受态,重组体,68,.,含氨苄平板,连接,目的基因,基因载体,连接酶,转化,重组体克隆的筛选与鉴定,筛选：,宿主细胞,69,.,外源基因在宿主细胞中的表达,重组子,目的基因的mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌,（E.coli）,工程细胞,表达：,目的基因表达产物的检测,70,.,重组DNA操作一般步骤,：,（1）,分,离,：提取和获得目的基因,和载体DNA；,（2）,切,割,：分别对目的基因和载体DNA,酶切,；,（3）,连,接,：目的基因与载体连接，,形成新的重组 DNA分子；,（4）,转,化,：用重组DNA分子转化受体,细胞；,（5）,筛,选,：能在受体细胞中复制和遗,传；对转化子筛选和鉴定,；,（6）,表,达：,对获得外源基因的细胞或生,物体通过培养，获得所需的,遗传性状或表达出所需要的,产物。,71,.,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,72,.,图2-1 基因工程技术流程图,73,.,基因工程表达依据的基本原理,提高外源基因的剂量,分子遗传学原理,筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：,启动子、增强子、操作子、终止子、,上游调控序列等分子生物学原理,修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：,SD序列、mRNA非编码区、密码子等,分子生物学原理,基因工程菌（,微型生物反应器,）增殖及稳定生产,生化工程学原理,74,.,基因工程的支撑技术,核酸凝胶电泳技术,核酸分子杂交技术,细菌转化转染技术,DNA序列分析技术,寡核苷酸合成技术,基因定点突变技术,聚合酶链反应（PCR）技术,75,.,运输工具：,细菌质粒,病毒,DNA操作技术,纯化DNA,剪切DNA分子,分析DNA片段大小,连接DNA分子,受体细胞的制备,将DNA转入受体细胞并扩增,重组子的筛选和鉴定,目的基因的表达,76,.,Thank You for,Your Attention!,谢 谢,77,.,