电转染标准步骤.doc

电转染标准步骤

1. 清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
2. 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
3. PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
4. 轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
5. 完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。
6. 加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。
7. 将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。
8. 电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
9. 将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
10. 正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
11. 培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。