DNA的复制1.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Molecular Biology Course,The replication of DNA,Molecular Biology Course,第五讲,DNA,的复制,一、,DNA,的复制,二、,RNA,的反转录,三、,DNA,的转座,Molecular Biology Course,脱氧核糖核酸（,DNA,）,是生物界遗传的主要物质基础。,生物有机体的遗传特征以密码的形式编码在,DNA,分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序即遗传信息。,在细胞分裂前通过,DNA,的复制，将遗传信息由亲代传递给子代。,在后代的个体发育过程中，遗传信息自,DNA,转录给,RNA,，,并指导蛋白质的合成，以执行各种生命功能。,使后代表现出与亲代相似的遗传性状，这种遗传信息的传递方向，是从,DNA,到,RNA,再到蛋白质，即所谓的生物学“中心法则”。,80,年代以后，在某些致癌,RNA,病毒中发现遗传信息也存在于,RNA,分子中，由,RNA,通过逆转录的方式将遗传信息传递给,DNA,。,这个中心法则加入了新的内容。这也就是我们前面提到过的，目前被生物界认可的遗传信息传递的中心法则。,Molecular Biology Course,复制,转录,反转录,翻译,DNA,RNA,PRO,生理功能,遗传信息传递的中心法则,Molecular Biology Course,第五讲,DNA,的复制,（一）、,DNA,的复制,（二）、复制的起始阶段,（三）、,DNA,复制的延长阶段以及参与的,酶和蛋白质分子,（四）,、,DNA,复制的终止阶段,（五）、复制的几种主要方式,（,六）、真核生物复制,Molecular Biology Course,DNA,复制（,the,Replication of DNA,）,亲代双链,DNA,分子在,DNA,聚合酶的作用下，分别以每单链,DNA,分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的,dNTP,合成出两条与亲代,DNA,分子完全相同的子代,DNA,分子的过程。,Molecular Biology Course,（一）、,DNA,的复制,1、,DNA,半保留复制的机理,2、,DNA,的半不连续复制,Molecular Biology Course,1、,DNA,半保留复制的机理,Semi-Conservation,Replication,DNA,作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确的自我复制，使,DNA,的量成倍增加，这是细胞分裂的物质基础。,1953年,Watson,和,Crick,提出,DNA,双螺旋结构模型，模型指出，,DNA,分子由两条多核苷酸链组成，两条链的碱基配对规则：,G,只能与,C,配对，,A,只能与,T,配对，以氢键相连，所以两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序。就是说，,DNA,分子的每一条链都含有合成它的互补链所需的全部信息,。,Molecular Biology Course,这就说明,DNA,的复制是由原来存在的分子为模板来合成新的链。,曾经有许多关于,DNA,复制方式,的学说，包括半保留复制，全保留复制以及分散复制等。,Watson,和,Crick,在提出,DNA,双螺旋结构模型时就推测，,DNA,在复制时首先两条链之间的,氢键,断裂开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的,DNA,链，这样新合成的子代,DNA,分子中一条链来自亲代,DNA，,另一条链是新合成的，这种复制方式为,半保留复制,。,Molecular Biology Course,Three replication hypotheses,1958年,Maselson,和,Stahl,利用,氮标记,技术在大肠杆菌中首次证实了,DNA,的半保留复制。,他们将大肠杆菌放在含有,N,15,标记的培养基中培养，得到,N,15,DNA。,然后将细菌转移到含有,N,14,标记的培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯密度梯度离心法观察,DNA,所处的位置。,由于,N,15,标记的,DNA,的密度比普通,DNA,的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的,DNA,分布在不同的区带。,Molecular Biology Course,实验结果,表明：,在全部由,N,15,标记的培养基中得到的,N,15,DNA,显示为一条重密度带，位于离心管的管底。,当转入,N,14,标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是,N,15,DNA,和,N,14,DNA,的杂交分子。,第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为,N,14,DNA,分子,和,N,14,N,15,DNA,杂合分子。,随着以后在,N,14,培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束从管底到管口，,CsCL,溶液密度，不同重量的,DNA,分子就停留在于其相当的,CsCL,密度处，在紫外光可以看到,DNA,分子形成的区带。,Molecular Biology Course,为了证实第一代杂交分子确实是一半,N,15,DNA,一半,N,14,DN,A,：将这种杂交分子经加热,变性,，对于变性前后的,DNA,分别进行,CsCL,密度梯度离心。,结果变性,前,的杂交分子为一条,中密度带,，变性,后,则分为,两,条区带，即,重,密度带（,N,15,DNA,）,和,低,密度带（,N,14,DNA,）。,它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释。,Molecular Biology Course,(CsCl gradient centrifuge),N15,N14,DNA,Semi-ConservationReplication,M.Meselson and F.W.Stahl,Sciences 44:675,1958.,1、,DNA,半保留复制的证据,Molecular Biology Course,模板,：能提供合成一条互补链所需要精确信息的核酸链。,Molecular Biology Course,2、,DNA,的半不连续复制,（,semi-discontinuous eplication,）,在体内，,DNA,的两条链都能作为模板，同时合成出两条新的互补链。,由于,DNA,分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为,5,3,，另一条链为,3,5,。,但是所有已知,DNA,聚合酶的合成方向都是,5,3,，而不是,3,5,。,这就很难说明，,DNA,在复制时，两条链如何能够同时作为模板合成其互补链。为了解释这一现象，日本学者岗崎提出了半不连续复制,模型,。,。,Molecular Biology Course,3,5,3,5,OK!,How?,5,3,5,3,1968,年，岗崎用,3,H,脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取,DNA,，,变性后用超离心法得到了许多,3,H,标记的，后人称为岗崎片断的,DNA,。,延长标记时间后，岗崎片度可转变为成熟的,DNA,链，因,此，这些片断必然是复制过程的中间产物。,Molecular Biology Course,但是冈崎等最初,不能确定,DNA,链的不连续只发生在一条链上还是两条链都如此。,对岗崎片断进行测定，结果测得的数据,远超过,新合成,DNA,的一半，似乎两条链都是不连续的。,后来发现，这是由于,尿,嘧啶代替,胸腺,嘧啶掺入,DNA,造成的。,DNA,中的尿嘧啶可被尿嘧啶,DNA-,糖苷,酶,切除，随后该处的磷酸二脂键断裂，一些核苷酸被水解，造成一个缺口，最后缺口空隙被填补和修复，在此过程中也会产生一些类似岗崎片断的,DNA,片断。,Molecular Biology Course,dUTP :dTTP,=1,：,300,in cell,-A-,-T-,-G-,-C-,A,U,G,U,dut gene,dUTPase,少数,dUTP,DNA,中不能有,U?,-A-,-T-,突变频率,=1/1200,！？,-A-A-,-U-,Ungase,ung,U,尿嘧啶,-N-,糖基酶,U,U,denature,dump fragment,1200base,Okazaki fragment,ung,dump fragment longer,dut,dump fragment shorter,A,A,当用缺乏糖苷酶的大肠杆菌变异株（,ung,-,进行实验时，尿嘧啶不再被切除。）,此时，新合成的,DNA,有一半放射性标记出现于岗崎片断中，另一股直接进入大的片断。由此可见，当,DNA,复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制,（,semi-discontinuous replication,）,。,Molecular Biology Course,前导链,(,leading strand,),：以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是,3,5,走向，在其上,DNA,能以,5,3,方向连续合成，称为前导链。,滞后链,(,lagging strand,),：另一条模板链是,5,3,走向，在其上,DNA,也是从,5,3,方向合成，但是与复制叉移动的方向相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片断，最后完成一条完整的,DNA,链，这条链称为滞后链。,Molecular Biology Course,DNA,的半不连续复制,Molecular Biology Course,DNA,复制的过程可以人为地划分成,3,个阶段,:,第一阶段,为,DNA,复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；,第二阶段,为,DNA,链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除,RNA,引物后填补空缺及连接冈崎片段；,第三阶段,为,DNA,复制的终止阶段。,DNA,复制的整个过程中需要,30,多种酶及蛋白质分子参加，我们将在,DNA,复制的各个阶段着重介绍它们的作用。,Molecular Biology Course,（二）、复制的起始阶段,1,、复制的起点,2、复制的方向,3、复制的速度,4,、,DNA,复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质,Molecular Biology Course,1、复制的起点,（,origin of replication）,很多实验都表明：复制是从,DNA,分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点常用,ori,或,o,表示。,细胞中的,DNA,复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组,DNA,的复制。,复制子（,The replicon,）,：,DNA,复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的,DNA,单位称为复制子或复制单元。,Molecular Biology Course,在原核生物中，每个,DNA,分子只有一个复制起点，因而只有一个复制子。,而在真核生物中，,DNA,的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个,DNA,分子上有许多个复制子。,Molecular Biology Course,DNA,复制起始点有结构上的特殊性。,例如：大肠杆菌染色体,DNA,复制起始点,Oric,由,422,个核苷酸组成，其中有,9,个核苷酸或,13,个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中,DnaA,蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体,DNA,是环状双链,DNA,。,DNA,是环状双链,DNA,，,它的复制是典型的,型复制。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。,Molecular Biology Course,二、复制的起始阶段,Molecular Biology Course,复制叉（,replication fork,）：,DNA,分子中正在进行复制的分叉部位。它由两条亲代链及在其上新合成的子链构成。,大多数生物体内,DNA,的复制都是从复制起点开始以双向等速形式进行。,少数为双向不等速或单向方式进行复制。,复制叉,2、复制的方向,（1）、定点开始双向复制,（2）、定点开始单向复制,（3）、两点开始单向复制,Molecular Biology Course,（1）、定点开始双向复制,这是原核生物和真核生物,DNA,复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链。,Molecular Biology Course,1、复制子,（2）,、定点开始单向复制,质粒,colE1,是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。,Molecular Biology Course,（3）,、两点开始单向复制,（3）,、两点开始单向复制,腺病毒,DNA,的复制是从,2,个起点开始的，形成,2,个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。,Molecular Biology Course,（3）,、两点开始单向复制,Molecular Biology Course,（3）,、两点开始单向复制,Molecular Biology Course,3、复制的速度,有双向等速的，也有双向不等速的。,Molecular Biology Course,4、,DNA,复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质,（,1,）,、,DNA,双螺旋解旋,（2）,、引发体的形成,Molecular Biology Course,（,1,）,、,DNA,双螺旋解旋,DNA,在复制时，其双链首先解开，形成复制叉。现在已经发现一些酶和蛋白质能使,DNA,双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛。,1）,、单链结合蛋白（,SSB,）,2）,、,DNA,解链酶（,DNA,helicase,）,3,）、,DNA,的解链过程,Molecular Biology Course,单链结合蛋白（,SSB,）,其作用是保证解链酶解开的单链在复制完成前保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环,.,Molecular Biology Course,DNA,解链酶（,DNA helicase,）,DNA,解链酶能通过水解,ATP,获得能量来解开双链,DNA,。,它分解,ATP,的活性依赖于单链,DNA,的存在。如果双链,DNA,中有单链末端或切口，则,DNA,解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。,大部分,DNA,解链酶可沿滞后链模板的,5,3,方向并随着复制叉的前进而移动，只有另一种解链酶（,Rep,蛋白）是沿着前导链模板的,3,5,方向移动。因此推测,Rep,蛋白和特定,DNA,解链酶分别在,DNA,的两条链上协同作用，解开双链,DNA,。,Molecular Biology Course,DNA helicases,DNA,的解链过程,DNA,在未复制前处于超螺旋结构，首先在拓扑异构酶的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。,在解链过程中除了解链酶，还有一些特异蛋白，如,DnaA,，,一旦局部解开双链，就必需有,SSB,蛋白来稳定解开的单链，以保证局部不会恢复成双链。,接着由引发酶等组成的引发体会马上作用于两条单链,DNA,。,不论前导链还是滞后链都需要一段,RNA,引物以开始子链,DNA,的合成。,Molecular Biology Course,（2）,、引发体（,primosome,）的形成,DNA,复制起始的关键步骤是前导,链,DNA,的合成，一旦前导链,DNA,的聚合作用开始，随从链,DNA,的合成也随着开始。,由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始只要有一段,RNA,引物，,DNA,聚合酶就能以此为起点，一直合成下去，相对简单。,而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由,DnaB,、,DnaC,和单链结合蛋白组成。,Molecular Biology Course,（2）,、引发体的形成,1,）、引物酶,2,）、引发体,Molecular Biology Course,引物酶（,primase,）,它是一种特殊的,RNA,聚合酶，可催化短片段,RNA,的合成，即引物的合成。,引物：是短,RNA,片段，一般十几个至数十个核苷酸不等，它能与单链,DNA,配对，并且提供了一个自由的3,OH,末端，该末端提供了由,DNA,聚合酶催化形成,DNA,分子第一个磷酸二脂键的位置。,Molecular Biology Course,DNA,聚合酶需要一个,3OH,末端以起始复制,（,primase,）,Molecular Biology Course,引发体,引发体由,6,种蛋白质,n,n,n,DnaB,、,C,和,I,共同组成，只有这,6,种蛋白质结合在一起并与引发酶进一步组装成引发体才能发挥其功效。,引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上浆进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物,RNA,短链，再由,DNA,聚合酶三作用合成,DNA,，,直至遇到下一个引物或岗崎片断为止。,Molecular Biology Course,Primosome,（,consists of six proteins,）,PriA(dual role)displace SSB from S.S DNA and helicase,DnaT,required at prepriming stage,DnaB is central component,action with DnaC,DnaC,is central component,action with DnaB,PriB,function is unknown,PriC,function is unknown,DnaG primase,replisome,（2）,、引发体的形成,Molecular Biology Course,（三）、,DNA,复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子,1、,DNA,聚合反应和,DNA,酶,2,、,与超螺旋松驰有关的酶：,Molecular Biology Course,DNA,的复制,DNA,的复制实际上就是以,DNA,为模板，在,DNA,聚合酶的作用下，将有力的四种脱氧单核苷酸（,dATP,，,dGTP,，,dCTP,，,dTTP,，,简写为,dNTP,）,聚合成,DNA,的过程。,这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多酶和蛋白质参与，现在分别叙述它们在,DNA,复制中作用。,Molecular Biology Course,Substrates required for DNA synthesis,+,n,1,dATP,n,4,dTTP,n,3,dCTP,+,n,2,dGTP,+,+,DNA,+,Mg2+,DNA,聚合酶,DNA,dAMP,dTMP,dCMP,dGMP,(n,1,+n,2,+n,3,+n,4,)PPi,Molecular Biology Course,1、,DNA,聚合反应和,DNA,酶,1957,年，,Arthur kornberg,首次在大肠杆菌中发现,DNA,聚合酶,I,，,简写为,DNA pol I,。后来又相继发现了,DNA,聚合酶,II,和,DNA,聚合酶,III,。,实验证明大肠杆菌中,DNA,复制的主要过程靠,DNA polIII,，,而,DNA polI,和,DNA polII,在,DNA,错配的修正和修复中起作用。,Molecular Biology Course,这种酶的共同性质是：,需要,DNA,模板,，因此这类酶又称为依赖,DNA,的,DNA,聚合酶。,需要,RNA,或,DNA,作为,引物,，即,DNA,聚合酶不能从头催化,DNA,的起始。,催化,dNTP,加到生长中的,DNA,链的,3-,OH,末端，因而,DNA,的合成方向是,5,3,三种,DNA,聚合酶都是,多功能酶,，它们在,DNA,复制和修复过程的不同阶段发挥作用。,Molecular Biology Course,1、,DNA,聚合反应和,DNA,酶,（1）、原核生物,DNA,聚合酶,（2）、真核生物,DNA,聚合酶,Molecular Biology Course,（1）、原核生物,DNA,聚合酶,1）、,DNA,合酶,I,2）、,DNA,合酶,3）、,DNA,合酶,Molecular Biology Course,1）、,DNA,合酶,I,DNA pol I,是由一条多肽链组成，分子量为,109,KD,。,酶分子中含有一个,Zn,2,，,是聚合活性必须的。,A,、,DNA,聚合酶的,5,3,聚合活性,B,、,DNA,聚合酶的,3,5,外切酶活性校对作用,C、,DNA,聚合酶的,5,3,外切酶活性切除修复作用,Molecular Biology Course,Molecular Biology Course,A,、,DNA,聚合酶的,5,3,聚合活性,这是,DNA,聚合酶最主要的活性，在引物,RNA 3-OH,末端，以,dNTP,为底物，按模板,DNA,上的指令由,DNApol,逐个将核苷酸加上去，就是,DNApol,的聚合作用。,酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板,DNA,配对时才有催化作用。,dNTP,进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进,3-,OH,与,5-,PO4,结合生成磷酸二酯键。,若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被,3-5,外切酶活性位点所识别并切除之。,Molecular Biology Course,1）、,DNA,合酶,I,Molecular Biology Course,B,、,DNA,聚合酶的,3,5,外切酶活性校对作用,这种酶活性的主要功能是从,3,5,方向识别和切除不配对的,DNA,生长链末端的核苷酸。,这种功能称为,校对,功能，这是保证聚合作用的正确性不可缺少的，因此，对于,DNA,复制中极高的保真性至关重要。,Molecular Biology Course,1）、,DNA,合酶,I,Molecular Biology Course,Molecular Biology Course,C、,DNA,聚合酶的,5,3,外切酶活性切除修复作用,5,3,外切酶活性就是从,5,3,方向水解,DNA,生长链前方的,DNA,链，主要产生,5-,脱氧核苷酸。,这种酶活性只对,DNA,上配对部份,(,双链,),磷酸二酯键有切割活力作用，方向是,5,3,。每次能切除,10,个核苷酸，而且,DNA,的聚合作用能刺激,5,3,外切酶活力达,10,倍以上。,因此，这种酶活性在,DNA,损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段,5,末端,DNA,引物的去除依赖此种外切酶活性。,Molecular Biology Course,DNA pol I,的,5,3,聚合活性和,5,3,外切酶活性协同作用，可以使,DNA,一条链上的切口从,5,3,方向移动，这种反应叫做缺刻平移，利用此反应可在体外对,DNA,片段进行放射性,P,标记制成探针，进行核酸的分子杂交实验。,Molecular Biology Course,1）、,DNA,合酶,I,Molecular Biology Course,1）、,DNA,合酶,I,Molecular Biology Course,2）、,DNA,合酶,此酶分子量为,120,KD，,每个细胞约有,100个,酶分子，但活性只有,DNa pol,的,5%,。,活性,5,3,聚合活性,3,5,外切活性,而没有,5,3,外切活性，它的作用可能与,DNA,损伤修复有关。,Molecular Biology Course,3）、,DNA,合酶,这是在,DNA,复制过程中,起主要作用,的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量,600,kDa,整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有,1000,个酶分子，但催化,dNTP,参入,DNA,链的速率却是最快的，约为,9000,核苷酸,/,每分钟,/,每个酶分子。,这也证明,DNa pol,是,DNA,复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体,DNA,进行复制时，,DNA,聚合酶,全酶并不是单独起作用的，而是与引发体等构成一个复制体,(,replisome),。,Molecular Biology Course,3）、,DNA,合酶,由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。,DNa pol,是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制,。,Molecular Biology Course,随着,DNA pol,向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断延长。,当岗崎片段合成到前一个片段的,5,端时，这冈崎片段就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后进行新的岗崎片段的合成。,由此模型不难看出：随从链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗崎片段的长度。,Molecular Biology Course,岗崎片段完成后，其,5,端的,RNA,引物由,DNa pol,的,5,3,外切酶活性切除，由此造成的空隙再由,DNA pol,的,5,3,聚合活性催化,dNTP,得到填补。所以,DNA,的复制是在,DNa pol,和,DNA pol,互相配合下完成的。,Molecular Biology Course,原核,DNA,聚合酶（,E.coli),聚合酶,聚合酶,聚合酶,5,3,聚合酶活性,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,作用,+,+,+,DNA,损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补，实践上其产生的“缺口平移”（,nick trans-lation）,技术也用于分子杂交时的核酸分子探针的标记,+,+,-,DNA,的修复,+,+,-,DNA,复制中子链的延长，为主导聚合酶,Molecular Biology Course,（2）、真核生物,DNA,聚合酶,1）、,DNA,聚合酶,2）、,DNA,聚合酶,3）、,DNA,聚合酶,Molecular Biology Course,2）、,DNA,聚合酶,它能以人工合成的多聚脱氧核糖核苷酸为模板，而以适当的寡聚脱氧核糖核酸链为引物合成,DNA。,此酶活性水平稳定，可能主要在,DNA,损伤的修复中起作用。,1）、,DNA,聚合酶,是真核生物的复制酶，它在细胞内的活性变化与,DNA,复制有明显的平行关系，在细胞分裂的,S,期达到高峰。,Molecular Biology Course,3）、,DNA,聚合酶,它能有效利用人工合成的多聚核糖核酸作为模板，以脱氧核糖核酸链为引物合成,DNA，,但不是反转录酶。它在分裂细胞中的活性有明显的变化，细胞进入,S,期后，它活性升高2倍，然后回到正常水平。它可能在分裂细胞,DNA,复制调控方面起作用。,Molecular Biology Course,2,、,与超螺旋松驰有关的酶,DNA,复制从起始点开始向一个方向复制时，局部的,DNA,双链必须打开，主要靠解链酶的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，在复制叉向前移动时造成其前方,DNA,分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。下面分别介绍它们的作用。,Molecular Biology Course,拓扑异构酶,(,topoisomerase),是一类改变,DNA,拓扑性质的酶。,在体外可催化,DNA,的各种拓扑异构化反应。,而在生物体内它们可能参与,DNA,的复制与转录。,在,DNA,复制时，复制叉行进的前方,DNA,分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及,DNA,的合成。,DNA,复制完成后，拓扑酶又可将,DNA,分子引入超螺旋，使,DNA,缠绕、折叠，压缩以形成染色质。,Molecular Biology Course,（四）,、,DNA,复制的终止阶段,DNA,在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。,Molecular Biology Course,连接酶,(,ligase),的作用是催化相邻的,DNA,片段以,3,、,5,磷酸二酯键相连接。,连接反应中的能量来自,ATP(,或,NAD,),。,连接酶先与,ATP,作用，以共价键相连生成,E,-,A,MP,中间体。中间体即与一个,DNA,片段的,5,磷酸相连接形成,E-AMP-5,DNA,。,然后再与另一个,DNA,片段的,3,-,OHH,末端作用，,E,和,AMP,脱下，两个,DNA,片段以,3,、,5,磷酸二酯键相连接。随从链的各个,DNA,片段就是这样连接成一条,DNA,长链。,Molecular Biology Course,已有研究证明大肠杆菌染色体,DNA,有复制终止位点,此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做,Tus,，,这个蛋白质可能是通过阻止解链酶,(,Helicase),的解链活性而终止复制的。,详细的机制还不完全清楚。,DNA,复制完成后，靠拓扑酶将,DNA,分子引入超螺旋结构。,Molecular Biology Course,（五）、复制的几种主要方式,1、线状,DNA,双链的复制；,2、环状,DNA,双链的复制：,1）,型复制；,2）滚环型复制；,3）,D-,环型；,Molecular Biology Course,1、线状,DNA,双链的复制,线状双链,DNA,上复制叉生长方式有单一起始点或多个起始点，在此形成复制眼，从复制眼开始复制叉可以单向(如腺病毒)及双向(如,T7)。,真核生物都为多复制眼起始的双向复制。,Molecular Biology Course,2、环形,DNA,双链的复制,型,大肠杆菌,DNA,环状分子半保留复制的中间产物就是,型。,复制的起点涉及到,DNA,双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。,复制从,ori,开始以顺时针和逆时针双向进行时，复制的中间产物在电镜下表现为,型。,Molecular Biology Course,2、环形,DNA,双链的复制,滚环型,环形,DNA,双链复制的一种，为单向复制。,复制过程中，首先形成共价闭环的双链分子（,RF,型），然后其正链由一核酸内切酶在特定位置切开，游离出3羟基和5磷酸基。5磷酸末端在酶的作用下固着在细胞膜上，随后在,DNA,聚合酶的作用下，以环状负链为模板，从正链的3羟基末端加入脱氧核苷酸，使链不断延长，通过滚环形成新的正链。,Molecular Biology Course,2、环形,DNA,双链的复制,D,环型,单向复制：双链环在固定点进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下呈,D,环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明：两条链的复制起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生,D-,环复制。,Molecular Biology Course,（,六）、真核生物,DNA,的复制,1、真核生物与原核生物,DNA,复制的区别,2、端粒和端粒酶,Molecular Biology Course,（,六）、真核生物,DNA,的复制,1、真核生物与原核生物,DNA,复制的区别 （1）、真核生物有多个复制起点,（2）、真核生物的染色体在全部完成之前，各个起点上,DNA,的复制不能再开始，而快速生长的原核生物种，复制起点上可以连续开始新的,DNA,复制，表现为虽只有一个复制单元，但可以有多个复制叉。,Molecular Biology Course,（,六）、真核生物,DNA,的复制,2、端粒和端粒酶,1）、端粒,2）、端粒酶,3）、端粒与衰老,4）、端粒酶与肿瘤,Molecular Biology Course,2、端粒和端粒酶,Molecular Biology Course,端粒,端粒,：,真核生物线性染色体3末端的一种特殊结构。核苷酸重复序列富含,G，,和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。人的,DNA,端粒含有,TTAGGG,重复序列，长度515,kb。,作用：,A,保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解；,B,解决染色体复制时末端丢失问题,端粒酶,能将端粒加到,DNA,末端的核糖核蛋白复合物，由多条肽链与一个,RNA,分子组成，端粒酶的蛋白质组分具有模板和逆转录酶的作用，但其逆转录酶活性只限于应用端粒酶特异的,RNA,作为模板。,Molecular Biology Course,端粒酶,Molecular Biology Course,端粒与衰老,实验,：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达 端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。,结论,：细胞的衰老是由端粒驱动的。,体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。,Molecular Biology Course,端粒与衰老,可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端粒钟”，或有丝分裂钟 或“生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。,胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。,Molecular Biology Course,端粒与肿瘤,人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。,肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。,端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。,Molecular Biology Course,端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。,可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。,Molecular Biology Course,二、逆转录酶,（一）、逆转录酶的发现,（二）、逆转录酶的性质,（三）、逆转录酶的功能,（四）、逆转录酶的基因组复制,（五）、逆转录酶的生物学意义,Molecular Biology Course,（一）、逆转录酶的发现,1964年，,Temin,发现,Rous,肉瘤病毒等,RNA,病毒所造成的感染可被,DNA,合成抑制剂遏制。,表明：,RNA,肿瘤病毒的,RNA,复制过程中要合成,DNA。,Temin,又发现放线菌素,D,能抑制致癌,RNA,病毒的复制，但不能抑制一般,RNA,病毒的复制。,表明：转录对于,RNA,病毒增殖是必需的。,Molecular Biology Course,Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。,1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。,Molecular Biology Course,（二）、逆转录酶的性质,它是由,亚基和,亚基组成，含有锌离子,；,DNA,合成反应要求有模板和引物；,以四种脱氧核苷三磷酸为底物；,DNA,合成方向也为53；,需要适当浓度的镁离子和还原剂。,Molecular Biology Course,（三）、逆转录酶的功能,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性,；,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,核糖核酸酶,H,的活力；,沿35和53两个方向核酸外切酶的活力。,Molecular Biology Course,（四）、逆转录病毒的基因组复制过程,1、由病毒（）,RNA,作为模板合成互补的（）,DNA,链,；,2、,切除,RNA-DNA,杂种分子中的,RNA,，然后由,（）,DNA,链作为模板合成,（）,DNA；,3、形成双链,DNA,；,Molecular Biology Course,Molecular Biology Course,Molecular Biology Course,Molecular Biology Course,乙肝病毒基因组,的复制,其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA