液相色谱的方法开发.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,液相色谱的方法开发,（一）分离方法,第一步干什么?,想办法得到各种信息,向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法,查文献，如,CA(,化学文摘),仪器制造商的文献，如,Waters,对色谱柱有足够的了解,掌握分离机理，自己开发方法,充分了解您自己的样品,分析时要了解哪方面的情况？,灵敏度的要求有多高?,样品的本底是否很复杂?,有多少组份要分析?,对分析的精确度、准确度等有多高要求?,是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,分离时要了解哪方面的情况？,要分离（即制备）的样品量有多大?,要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?,是否需要保持生物活性?,对分离产物纯度的要求有多高?,纯度或活性的鉴定如何完成?,一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱,用相对较高的流速,使用尽可能纯度高的标准品,先用高强度的洗脱液,调节,k,值改变保留值,调节,a,值改变选择性,调节柱长度改变柱效及分离速度,使用文献方法,色谱柱填料的种类、品牌是否相同?,注意文献方法的流动相,是否损害色谱柱?,如色谱填料品牌不同，需要调整流动相,注意色谱柱的规格：内径、柱长,需要调整流速、进样量,注意梯度条件,了解系统的滞后体积（梯度）,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱,转换进样量,转换流速,反相色谱的方法开发,开发过程实例,色谱条件,色谱柱：,C18，4mm30mm,流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱,流速：2,ml/min,样品：,对羟基苯甲酸甲酯(,Methyl,Paraben,),对羟基苯甲酸丙酯(,Propyl Paraben,),对羟基苯甲酸丁酯(,Butyl,Paraben,),改变容量因子,K,谱图,改变选择性,a,通过改变流动相改变选择性,同样强度的不同溶剂,改变色谱柱,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法,主要用于,“,强,”,阴、阳离子,使用反相柱,离子抑制色谱法,通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,离子对色谱法,加入,“,对离子,”,，使样品呈中性,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的,pH,值，抑制样品离子的电离,适用于弱酸性化合物的分离,降低流动相的,pH,值，使样品降低离子化,使用硅胶基质,C,18,填料,使用条件应在填料基质的范围内,硅胶柱的,pH,在2-8（较保险值3-7）内,常用缓冲液及其,pH,值,离子抑制色谱实例,在乙腈/水及,pH=7,时，多数保留时间很短，无法完全分离。,离子抑制色谱的使用范围,如果：,一些酸在,pH,低于2时还保持离子化,一些碱在,pH,高于7时还保持离子化,可以有以下的选择,离子交换色谱,使用聚合物反相柱，在,pH,高于7时用离子抑制法,使用,“,离子对色谱法,”,在高,pH,值下用离子抑制,色谱柱：,D18-613(,聚合物基质)，室温,流动相：乙腈/0.01,M NH4OH+0.01M TBA,流 速：1.0,ml/min,检 测：,UV-240nm,样 品：巴比妥的衍生物,巴比妥,己琐巴比妥,甲基苯巴比妥,速可巴比妥,离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入,“,离子对,”,试剂,与样品中可电离的组份形成,“,对离子,”,在反相色谱柱上分离离子型化合物,离子对试剂的类型,PIC A：,磷酸季丁铵，适用于弱酸,PIC B：,烷基磺酸盐，适用于弱碱,烷基长度不同，形成对离子的能力不同,通常有：,B5，B6，B7，B8,PIC D4：,磷酸二丁胺，适用于弱碱,离子对色谱机理,用离子对？还是离子抑制？,抗组胺及减充血剂药物的分析,离子对色谱的应用,使用五烷基磺酸盐,Packing:,Bondapak,C,18,Column:,4 mm ID x 30cm,Solvent:,Methanol/H,2,O with 0.005M PENTANE,Sulfonic,Acid&1%,HOAc,(50/50),Flow Rate:2.0 ml/min,Detector:UV,254,nm,0.1 AUFS,1.,Maleic,Acid,2.,Phenylephrine,3.,Phenylpropanol,-amine,4.,Naphazoline,5.,Phenacetin,6.,Pyrilamine,使用六烷基磺酸盐,Packing:,Bondapak,C,18,Column:4 mm ID x 30cm,Solvent:Methanol/Water with 0.005M HEXANE,Sulfonic,A,c,id,&1%,HOAc,(50/50),Flow Rate:2.0 ml/min,Detector:UV,254,nm,0.1 AUFS,1.,Maleic,Acid,2.,Phenylephrine,-,HCl,3.,Phenylpropanolamine,-,HCl,4.,Naphazoline,-,HCl,5.,Phenacetin,6.,Pyrilamine Maleate,使用七烷基磺酸盐,1.,Maleic,Acid,2.,Phenylephrine,3.,Phenylpropanolamine,4.,Naphazoline,5.,Phenacetin,6.,Pyrilamine,Packing:,Bondapak,C,18,Column:4 mm ID x 30cm,Solvent:Methanol/Water with 0.005M HEPTANE,Sul,f,onic,A,c,id,&1%,HOAc,(50/50),Flow Rate:2.0 ml/min,Detector:UV,254,nm,0.1 AUFS,样品浓度对分析的影响,离子对色谱分析水溶性维生素,用不同的离子对试剂,离子对色谱-水溶性维生素,方法开发的其他因素,流速对柱效的影响,不同内径的色谱柱有自己的最佳流速,样品的进样量(浓度)对柱效的影响,样品的进样体积对柱效的影响,溶剂粘度对柱效的影响,以上因素均影响分离度,结论,充分用已知样品结构确定以哪种方法开始,普通反相?离子抑制?离子对?还是其他,观察流动相条件改变时色谱峰的移动,根据变化的方向及大小决定下一步干什么,改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！,色谱柱的改变影响最大,