基因工程受体ppt课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 基因工程的受体系统,1,、大肠杆菌受体系统 基因复制,原核细胞,2,、芽孢杆菌受体系统 扩增场所,受体系统,3,、其他细菌受体系统 外源基因,表达场所,1,、酵母菌受体系统,真核细胞,2,、哺乳动物细胞受体系统,受体系统,3,、,植物细胞受体系统,受体,(,宿主,)Host:,能支持质粒,病毒进行复制的生物体。,受体系统,1,一、,E.coli,受体系统,大肠埃希氏菌,(,E.coli,),通常称为大肠杆菌，是,Escherich,在,1885,年发现的,2,1,、,E.coli,受体系统的特点,遗传背景清楚,利于研究,繁殖快,易于获得大量基因产物,含有质粒,利于基因转移,表达非,E.coli,基因，其潜力几乎是无限的,3,4,2,、,E.coli,受体系统的优点,遗传背景清楚,利于研究,繁殖快,易于获得大量基因产物,含有质粒,利于基因转移,表达非,E.coli,基因，其潜力几乎是无限的,5,3,、,E.coli,受体系统的缺点,高水平表达的基因产物易发生沉淀，凝聚，,不易折叠，无生物活性,基因产物纯化工艺复杂（大海捞针）,基因产物受污染（内毒素）,基因产物对受体菌有毒害作用,基因产物易被水解,从安全角度,并不理想,缺乏基因产物表达后加工机制,6,基因型：,endA1 gyrA96(nalR)thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+lacIq(lacZ)M15 hsdR17(rK-mK+),。,特点：具有四环素抗性和萘啶酮酸抗性。,recA1,和,endA1,的突变有利于克隆,DNA,的稳定和高纯度质粒,DNA,的提取。,用途：分子克隆和质粒提取。,Xl1-Blue,菌株,endA1=,elimination of non-specific digestion by Endonuclease I,recA1=,For reduced occurrence of unwanted recombination in cloned DNA,7,基因型：,F,ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-)(DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5),。,特点：该菌株用于以,T7 RNA,聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。,T7,噬菌体,RNA,聚合酶基因的表达受控于,噬菌体,DE3,区的,lacUV5,启动子，该区整合于,BL21,的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。,用途：蛋白质表达。,BL21(DE3),菌株,ompT=,mutation in outer membrane protein protease VII,reducing proteolysis of expressed proteins,8,基因型：,F,-,ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-)(DE3)pLysS(cmR),。,特点：该菌株带有,pLysS,，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达,T7,溶菌酶的基因，,T7,溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰,IPTG,诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。,用途：蛋白质表达,BL21(DE3)ply,菌株,9,基因型：,F,-,endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK-,特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其,80dlacZM15,基因的表达产物与,pUC,载体编码的,-,半乳糖苷酶氨基端实现,互补，可用于蓝白斑筛选。,用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。,DH5菌株,10,基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+(lac-proAB)e14-F traD36 proAB+lacIq lacZM15hsdR17(rK-mK+)。,特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达,可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。,用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。,JM109菌株,11,基因型：,F,-,，,mcrA(mrr-hsd RMS-mcrBC),，,80,，,lacZM15,，,lac74,，,recA1,，,ara139(ara-leu)7697,，,galU,，,galK,，,rps,，,(Strr)endA1,，,nupG,用途：高效的,DNA,克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。,TOP10,菌株,12,第三节 基因工程的受体系统,1,、大肠杆菌受体系统,原核细胞,2,、芽孢杆菌受体系统,受体系统,3,、其他细菌受体系统,1,、酵母菌受体系统,真核细胞,2,、哺乳动物细胞受体系统,受体系统,3,、,植物细胞受体系统,受体系统,13,二、枯草杆菌受体系统,芽抱杆菌是一类耐高温、高压及低,pH,值的,有益微生物,14,1,、枯草杆菌（,Bacillus subtilis,）受体系统特点,最大优点：外分泌,高水平表达，基因产物不发生沉淀,纯化基因产物相对简单,基因产物污染少,基因产物不易被水解,安全,遗传背景仅次于,E.coli,2,、缺点：,转化效率相对较低,表达水平较低,15,1.,乳酸杆菌受体系统的独特优势,:,乳酸杆菌是食品级微生物,乳酸杆菌本身分泌蛋白较少,Usp45,是迄今已知乳酸杆菌分泌的唯一可检测蛋白,减少了载体微生物的自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰,乳酸杆菌不产生任何细胞外蛋白酶,不会引起分泌蛋白发生细胞外的降解。,三、乳酸杆菌受体系统,16,2.,乳酸杆菌作为疫苗载体的优越性：,在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植,对维持微生态平衡很重要。,在发酵食物中应用了几个世纪,被认为是安全的有益微生物。,免疫方便、便宜、安全,不需要注射,无免疫原性,17,四、酵母菌受体系统,18,安全性更大,遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达,基因产物外分泌,遗传背景较清楚,具基因表达后加工机制,1.,酵母菌受体系统的特点,19,2.,常用酵母菌受体系统,酿酒酵母,甲醇酵母,20,酿酒酵母,酿酒酵母（,Saccharomyces serevisiae,）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的“大肠杆菌”。,1.,酿酒酵母表达系统表达外源基因的优点,：,酿酒酵母培养条件普通，生长繁殖迅速，用于表达基因工程产品时，工艺简单，可以大规模生产，有效降低生产成本；,它不会产生毒素，安全可靠。,酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，特别适合于表达真核生物基因；,外源基因可在酿酒酵母中分泌表达，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化，而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响；,酿酒酵母的遗传背景清楚，容易进行遗传操作。,21,2.,甲醇酵母受体系统的优点：,含特有的,AOX,（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可以严格地调控表达。,有完备的发酵方法,可以高密度连续培养，其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质，蛋白产量高。,适应能力强，易于操作，可以在廉价的非选择性培养基中生长。,基因表达产物既可在胞内，又可被分泌到胞外，分泌的异源蛋白质占所有被分泌蛋白的,30%,以上，利于工业规模的生产。,能对要表达的多肤和蛋白质进行翻译后加工处理。,甲醇酵母（毕氏酵母）,22,3.,巴氏毕赤酵母的优点：,对外源蛋白的糖基化等更接近于哺乳动物细胞,表达蛋白水平高出酿酒酵母,10-100,倍。,23,1.,动物受体系统,优点：,表达外源基因具有后加工系统，基因产物具动物活性,2.,动物受体系统,缺点：,较难大规模培养，培养速度慢,五、动物受体系统,24,具全能性，较易组织培养，可诱导出植株,基因工程植物。也可通过组织培养直接获得基因产物。,六、植物受体系统,25,