实验植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳市公开课特等奖市赛课微课一等奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验九-十 植物过氧化物酶同工酶 测定（凝胶圆盘电泳法）,生物化学试验之,山东师范大学生命科学学院,第1页,【试验目标】,1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理；,2.掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳操作技术；,3.学习过氧化物酶同工酶检测方法。,第2页,【试验原理】,以聚丙烯酰胺为支持介质电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。,聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，含有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调整。,第3页,聚丙烯酰胺凝胶结构,第4页,PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效应。因为被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状差异，所以在电泳时产生不一样永动速率而相互分离。利用特异性颜色反应使待测酶着色，这么就能够在凝胶中展现出酶谱。,第5页,为了提升聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率,通常采取不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中离子成份、pH、凝胶浓度不一样，电泳开始后，因为浓缩效应,较厚样品层能够被浓缩很薄，使电泳含有良好分辨率。,第6页,过氧化物酶是植物体内常见氧化酶。它能催化H,2,O,2,将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。所以，将经过电泳后凝胶置于H,2,O,2,-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在位置，多条有色带即组成过氧化物酶同工酶酶谱。,第7页,【器材与试剂】,（一）材料 小麦芽,（二）仪器设备,稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、,成套电泳槽（圆盘型），pH试纸，其它常规用具,（三）试剂,1、分离胶缓冲液（pH 8.9）2、分离胶贮液,3、过硫酸铵溶液 4、浓缩胶缓冲液,5、浓缩胶贮备液 6、电极缓冲液,7、四甲基乙二胺（TEMED）8、0.1%溴酚蓝溶液,9、联苯胺染色母液,第8页,【试验步骤】,（一）过氧化物酶提取：取812粒发芽麦粒，加入1ml H,2,O 或0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵壁并全部转入离心管，4000r/min离心10 min，上清液供电泳分析用。,第9页,（二）凝胶制备,1.准备工作：,（1）将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm处。,（2）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。,第10页,3.制备小孔胶（分离胶）,取2个小烧杯，按A:C:水:F等于1:2:1:3百分比，分别取A液、C液和水置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中。将两个小烧杯同时放在真空干燥器中同时抽气510min，可见有气泡冒出。,第11页,将2个小烧杯内液体倒在一起轻轻混匀（勿重新带入空气），用滴管先取少许凝胶液加至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至达高度距上端口1cm为止。仔细地向表面加一层水以隔绝空气。此时可 见水与胶之间有一界限，但很快消失。,将玻璃管垂直固定在一试管中，置2535温箱聚合3060min，当再次看到水与凝胶之间界限时，表示聚合完成。吸去表面水。,第12页,4.制备大孔胶（浓缩胶）,取2个小烧杯，按照B:D:E:F等于1:1.5:1:4百分比，分别取B液、D液和E液置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中，抽气。将2个小烧杯内液体轻轻混匀加至小孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。2535聚合2030min，聚合后大孔胶呈乳白色。仔细吸去表面水。,第13页,（三）电泳1.安装电泳槽：向电泳槽下槽加入适量甘氨酸Tris电泳缓冲液。去掉玻璃管下端封口膜，将玻璃管固定在电泳槽上，阴极在上，阳极在下。,第14页,2.点样：取样品50L，蔗糖溴酚篮50L,混匀，加入玻璃管中。加缓冲液至浸没过玻璃管上端口及电泳槽上盖电极。排除玻璃管下端口气泡，连接好电泳仪。,第15页,3.电泳：开始电流为23mA/管，当样品至分离胶时，电流加大到45mA/管。当溴酚蓝指示剂靠近管底时切断电源，终止电泳。,第16页,4.剥胶：取下玻璃管，用装有长针头注射器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管中。,第17页,（四）染色：,临用时配制染色液：（10,ml,）,联苯胺母液 0.5 ml,H,2,O 9.3 ml,3%H,2,O,2,0.2 ml,将染液倒入盛有凝胶条试管中（没过胶条）。约10min后用自来水冲洗。,第18页,（五）统计并计算：,观察、统计酶谱，并计算各同工酶相对迁移率。,第19页,【关键点提醒】,1.分离胶聚合时间应控制在3060min，聚合过快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过量引发；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或TEMED用量不足或已失效。,2.电泳时假如电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压或电流过大，体系发烧，可引发蛋白质变性、凝胶底部断裂等，应注意调整。尤其是进入分离胶后应经过控制电压，调整电流不超出5mA/管。,第20页,【思索题】,1说明不连续电泳中浓缩效应主要是怎样引发？,2.为何要在样品中加入少许溴酚蓝和一定浓度蔗糖溶液？,3.采取凝胶圆盘电泳法测定过氧化物酶同工酶原理怎样？有什么特色？操作中注意事项有哪些？,第21页,