DB4203∕T 196-2021 黑木耳液体菌种生产技术规程(十堰市).pdf

ICS 65.020.20 B 39 DB4203 湖北省十堪市地方标准DB 4203/T 196-2021 黑木耳液体菌种生产技术规程2021 -5 -20发布2021-5-25实施十堪市市场监督管理局发布本文件依据GB!T1. 1-2020的规定编写。本文件由十堪市农业科学院提出并归口。目IJ1=1 DB4203月196-一2021本文件起草单位:十堪市农业科学院、房县天禾食用菌专业合作社、房县荣森食用菌科技开发有限公司、房县农业农村局、十堪市植物保护和检疫站、十堪市蔬菜科学研究所、竹山县农业农村局。本文件主要起草人:刘杰、李军、肖艳、蔡娟、常望、李世华、田继成、秦光明、胡艳萍、张九玲、罗义、陈昌东、蒙天绿、蔡明、汪远飞、王巍、齐明师、柯磊、石霞。本文件由十堪市农业科学院负责解释。本标准实施应用中的技术疑问，可咨询十堪市农业科学院，联系电话[phone]，邮箱;对本标准的有关修改意见建议请反馈至十堪市农业科学院，联系电话。719-8465930，邮箱。DB4203/ T 196-一2021黑木耳液体菌种生产技术规程1 范围本文件规定了黑木耳液体菌种的生产条件、原始种选择、液体菌种生产技术、记录与存档等。本文件适用于十堪市区域内利用液体菌种技术生产代料黑木耳菌包及黑木耳栽培种。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件:不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB!T 150 压力容器(所有部分)GB/T 13554 高效空气过滤器GB 19153 容积式空气压缩机能效限定值及能效等级GB 50073 洁净厂房设计规范NY/T 528 食用茵茵种生产技术规程NY 5099 无公害食品食用菌栽培基质安全技术3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 液体菌种使用液体培养基在发酵罐中通过深层培养(液体发酵技术生产的液体形态的、有别于传统固体菌种的菌种。3. 2 液体菌种培养罐进行食用菌液体菌种培养的专用设备，包括固定式和可移动式两种类型，为不锈钢材质。3. 3 摇瓶种将母种接种于装有无菌液体培养基的三角瓶(又称摇瓶)中，经摇床振荡培养得到的液体菌种，主要用于母种的扩大培养并接入到发酵罐中继续培养。3.4 放罐液体菌种培养结束，将液体菌种从发酵罐内排出并接种于栽培袋中。4 生产条件2 DB4203月196-20214. 1 场地选择与厂房布局场地选址符合NY/T528的规定。设置有菌种配置室、灭菌室、无菌净化操作室、恒温培养室、发酵罐培养室、化验室、接种室，液体菌种培养室和接种间符合GB50073要求。配备调温设施、排水系统及排水设施，按照液体菌种生产工艺流程合理布局，无菌区与有菌区有效隔离，并设置无菌缓冲区。4.2 生产仪器与设备液体菌种培养罐应符合GB/T150的要求，高压蒸汽锅炉应符合GB/T 150的要求，空气压缩机应符合GB19153的要求，空气过滤器应符合GB/r13554的要求，高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、显微镜、天平、冰箱等应符合NY/T528的要求，其他设备包括恒温振荡培养箱、磁力搅拌器、液体菌种接种枪等。4. 3 5 6 6. 1 原材料及投入品生产菌种所需的款皮、琼脂、玉米粉、葡萄糖等原材料及投入品应符合NY5099的要求。原始种选择从具有相关资质的单位引种，应选用产量高、菌丝生长健壮、抗逆性强、商品性好的黑木耳品种。生产技术生产工艺流程液体菌种生产工艺流程见图10培养基配置1-1)Zffi 1 - 1 tp 1一母种制备|摇瓶种制备|l 液体菌种培养l 放键接种图1生产工艺流程图空气净化6. 2 母种制备6. 2.1 母种培养基的配置制作PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)或者CPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，3 DB4203/ T 196-一2021分装入试管(18mm X 18 cm或者20mm X20 cm)至试管长度五分之一到四分之一，使用棉塞或者硅胶塞封口，121 oc灭菌30min，灭菌后趁热将试管摆成斜面，斜面培养基顶端距离试管口不少于3cm。6. 2. 2 接种与培养在无菌条件下，将原始种接种于母种培养基上，接种后置于培养箱内避光培养，培养温度为250C，培养12d15 d，并每天检查，及时拣出污染及生长速度异常的每种。6. 3 摇瓶种制备6.3.1 配方去皮马铃薯200g，款皮20g，葡萄糖20g，磷酸二氢饵2g，硫酸镇1g，加水至1000mL。6. 3. 2 培养基的制备将配方中的原料煮沸20min30 min，三层纱布过滤，过滤后的液体分装至500mL或1000mL三角瓶中，500 mL三角瓶装液量为250mL300 mL. 1000 mL三角瓶装液量为500日lL600mL.并加入磁力搅拌器转子l粒。分装好的三角瓶使用棉塞或者硅胶塞封口，并用牛皮纸包好。配置好的培养基121 oc灭菌30min。6. 3. 3 接种和培养无菌条件下将试管母种接种于摇瓶液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中培养，温度250C，转速140 r/min，培养48h，当摇瓶内有大菌球出现时，将摇瓶放在磁力搅拌器上搅碎至絮状，重新放回恒温振荡培养箱160r/min继续培养5d7 d。6. 3. 4 筛检培养过程中要定时观察，优质的摇瓶种发酵结束时菌液应该是呈金黄或者透明状，菌球表面能看见绒毛状的生长点。如果观察到菌液有浑浊现象、菌球形状不均匀或者菌球表面光滑无绒毛，则摇瓶种不能继续使用。在摇瓶种接近培养结束前24h，将摇瓶倾斜让菌球挂到瓶壁上面部分，然后继续培养24h，观察瓶壁上面菌球萌发的情况，根据萌发的形状和速度判断菌球的质量。6. 4 洗罐与空消每一次制作菌种前液体菌种发酵罐都要用高压水枪进行彻底清洗，洗罐要做到无死角。发酵罐首次使用或者是发酵污染后，要对发酵罐进行空消，具体做法是:在发酵罐内部加水至容积的80%，然后加热到125oC灭菌30min。6. 5 液体菌种培养基配置6.5. 1 配方照糖20 g，磷酸二氢押1g，硫酸镜1g，款皮30g，玉米粉20g，力日7.k至1000mL.其中款皮和玉米粉过80目筛备用。6. 5. 2 培养基制作用温水00o C 40 oC)将玉米粉和鼓皮搅拌均匀，不能有结块，注入到发酵罐中，再加入其它培养料，最后加入3mLlL消泡剂，边加料边注入清水，直至到发酵罐总容积的80%。4 D84203/ T 196-一20216. 6 页菌加完培养料后立即通气搅拌，然后升温高压灭菌，125 oc灭茵1h。6. 7 冷却灭菌结束后要迅速向发酵罐夹层通入冷却循环水，使发酵罐内培养基冷却，防止罐内长时间高温，培养基糊化影响培养效果。6. 8 液体菌种接种培养基冷却到28oc时即可进行接种，接种之前将摇瓶种表面用75%酒精消毒。将发酵罐压力调整到0.01MPa，用酒精火焰封闭接种口，缓慢打开接种口，迅速倒入菌种，盖好接种口。6. 9 液体菌种培养接种之后通过气泵充气和调整放气阀将发酵罐内气压调节至0.02MPaO.03 MPa之间，温度控制在25oc进行液体菌种培养，培养7d可达到放罐标准。培养期间要注意检查，尤其是排气时尾气的气味，如果发现尾气有酸臭味，则无害化倒罐处理。6.10 液体菌种检测6. 10.1 取样接种后4d进行检测，用酒精火焰球灼烧取样阀min，弃掉最初流出的少量液体菌种，取50mL 液体菌种放入经灭菌的三角瓶中，塞紧棉塞，取样后用酒精火焰将取样阀烧干。6.10. 2 脸测将所取样品经无菌操作接种于试管或者培养皿中，25 oc下培养2d3 d，采用 显微镜和感官观察菌丝生长情况，判断有无污染。6. 11 液体菌种放罐指标6. 11. 1 感官指标感官指标见表10项目色泽形态气味6. 11.2 理化指标理化指标见表2。表1感官指标感官指标球状菌丝体呈白色，菌液呈棕色。菌液稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层。有黑木耳液体培养时特有的气味，无异味(如酸味、臭味)，发酵罐排气口气味正常。5 DB4203/ T 196-一2021表2理化指标项目理化指标pH值5. 56. 0 菌丝温重(g/U二;:80显微镜下菌丝形态可见黑木耳菌种液体培养时特有的菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，茵丝粗斗士。样品无菌检查有黑木耳菌丝生长，无细菌、莓菌等杂菌生长。6.12 放罐接种接种前发酵罐保持正常的罐压，液体菌种接种枪高压灭菌后使用，将待接种的黑木耳栽培袋放置于输送带，输入至无菌接种区，在接种区用液体菌种接种枪将黑木耳液体菌种注入，每个接种点接种25mL30 mL。7 记录与存档黑木耳母种、摇瓶种和液体菌种生产的每个环节都要有详细的生产记录，由具体操作人员现场记录并归档保存，生产记录应保存2年以上。6