基因工程载体.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四节,.,基因工程载体,第四节.基因工程载体,基因工程载体（,vector,）,。,承载体外源,DNA,片段（基因）,并将其带入受体细胞的,传递者,。,基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。,目前已构建应用的基因工程载体主要有,质粒载体,噬菌体载体,病毒载体,人工构建的组合载体,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(1),1.质粒载体,质粒(,plasmid,)是,能自主复制的双链环状,DNA,分子,，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个,DNA,分子，其大小可从,1 kb,到,200 kb,。,质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。,质粒,DNA,的特点为：,双链环状；,分子量很小；,自主或半自主复制；,不同生物质粒中的基因种类不同。,DNA cloning using bacterial plasmids,E.Coli,chromosome,Plasmid,Purify,plasmid DNA,Purify,human DNA,Treat with EcoR1 to,cleave both human,and bacterial DNA,into different sized,fragments,Insulin gene,Incubate E.coli cells,under conditions,where they will take,up plasmids from,the medium,Population of,plasmids,containing different,segments of,human DNA,Plasmid free,E.coli,Join fragments,into recombinant,DNAs with DNA,ligase,Ribosomal,RNA gene,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(4),质粒载体pUC 18/19,这对载体由,2686 bp,组成，带有复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子,-半乳糖苷酶基因(,lacZ,)的调节片段，一个调节,lacZ,基因表达的阻遏蛋白,(repressor),的基因,lac I,，还有多个单克隆位点。,由于,pUC,质粒含有,Amp,r,抗性基因和,lac Z,基因，可以通过颜色反应和,Amp,r,对转化体进行双重筛选。,多克隆位点,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(5),质粒载体,pUC 19,Lac Z 半乳糖苷酶基因，在含Xgal培养基上呈蓝色，插入外源DNA，重组子培养呈白色,MSC 区段,pUC优点：,具有更小的分子量，更高的拷贝数；,适用于用组织化学方法检测重组子；,具有多克隆位点,MSC,区段，与,M13mp8,噬菌体相同的克隆区段,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(6),质粒载体必须具备的基本条件：,具有复制起点,具有抗菌素抗性基因,具有若干个限制酶单一识别位点,具有较小的分子量和较高的拷贝数,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(7),2.噬菌体(,Bacterophage,)载体,噬菌体,噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的,DNA,，最常见的是,双链线形,DNA,且感染率高。,0.02-0.3,m,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(8),噬菌体的形态,第四节.基因工程载体,SARS 冠状病毒,果子狸,第四节.基因工程载体,噬菌体的生命周期,Virus attached to cell,Virus DNA injected into cell,Virus DNA remains separated from host chromosome,Virus DNA integrated into the host chromosome,Bacteria reproduced with integrated provirus,Lysogenic pathway,Lytic pathway,Virus released as cell lysis,Virus particles assembled,Host DNA degraded,Virus DNA and protein synthesized,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(9),噬菌体的cos末端,COS,5-CGGGGCGGCGACTCG-3,3-GCCCCGCCGCTGAGC-5,5-CG GGGCGGCGACTCG-3,3-GCCCCGCCGCTGA GC-5,COS,非必须区,长臂(左),短臂(右),噬菌体,噬菌体染色体组,蛋白外壳,DNA,噬菌体COS末端,连接（感染后）,裂解（包装过程）,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(10),噬菌体,275,000,Scanning electron microscopy,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(11),用噬菌体作为克隆载体,第四节.基因工程载体,用于原核生物宿主的载体(12),噬菌体DNA的复制,（1)感染早期，环形DNA分子可以按,形式从双向进行复制；感染晚期，滚动复制。,（2)稳定整合到染色体DNA上复制。,噬菌体载体可以成功的应用来作为,扩增外源基因拷贝数,的克隆载体，使外源基因得到最大限度的表达。已经应用,噬菌体载体实现基因克隆和表达的有DNA连接酶、DNA聚合酶I和聚合酶III,亚基等。,第四节.基因工程载体,用于真核生物宿主的载体,1.酵母质粒,酵母的2质粒来自酿酒酵母，内含复制起始区(ori)和能够使质粒在受体中稳定存在的STB序列。此质粒为双链环状，6813 bp，与原核生物的质粒不同，2质粒常被组蛋白包围。,常用：毕赤酵母,第四节.基因工程载体,用于植物宿主的载体,由于植物细胞的特殊结构，外源基因导入植物细胞的方法目前还很有限。,1.,Ti,质粒,Ti,质粒上土壤农杆菌的质粒。土壤农杆菌通过植物伤口侵入植物后，,Ti,质粒的,T,区整合到植物染色体中。,T,区的,DNA,长约,20kb,，它携带的基因有两个功能：一是决定植物形成冠瘿瘤；二是控制冠瘿碱的合成。,2.植物,DNA,病毒,已知以,DNA,为遗传物质的植物病毒有花椰菜花叶病毒、雀麦条纹病毒和双生病毒。至今使用很少。,3.植物转座子,转座子能在植物基因组中频繁转移，有望成为一种新的植物载体。,第四节.基因工程载体,用于动物宿主的载体,哺乳动物细胞用于外源,DNA,表达采用的载体至今很有限，目前主要是用猿猴空泡病毒,40(SV40)。SV40,病毒内含双链环状,DNA,，,5243bp,，只能插入,2.5kb,的外源,DNA,。,改造后出现的,SV40,病毒载体有两大类：,（1）取代型，外源,DNA,直接插入在缺陷型的病毒基因组中，为了弥补被取代的这部分,DNA,的功能，必须同时使用一种与之互补的辅助病毒；,（2）病毒一质粒重组型，将病毒基因组中维持其在哺乳动物中复制的序列分离并和细菌质粒重组，这类质粒在大肠杆菌和哺乳运动细胞中均可复制，属于穿梭载体。,用于哺乳动物宿主的病毒载体还有,RNA,病毒、痘病毒、人腺病毒、乳头瘤病毒等。,第四节.基因工程载体,克隆载体必须具备的性质：,能够进入宿主细胞,不能太大。,质粒大于,15kb,时，其将外源,DNA,转入大肠杆菌的效率将大大降低。,对于多种酶，具有单一的限制性内切酶位点（克隆位点）,有多个选择性标记,可以在载体细胞中独立复制，即本身是一个复制子,第四节.基因工程载体,基因工程载体的分类,DNA,重组使用的载体可以分为三大类,（,1,）克隆载体：,以,繁殖,DNA,片段为目的,的载体,这类载体较小，复制不受寄主的严格控制，即自身有很强的复制能力，在细胞内可以有很高的拷贝数，寄主的,DNA,复制停止时，这类载体仍能扩增。,pBR322,、,pUC,系列、,M13,系列载体均属于克隆载体。,第四节.基因工程载体,基因工程载体的分类,（2）穿梭载体：,即能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖。,这类载体有真核细胞和原核细胞,两种复制点,。穿梭载体常用于真核生物,DNA,片段在原核生物中的繁殖然后再转入真核细胞宿主。,第四节.基因工程载体,基因工程载体的分类,（3）表达载体,。通过,DNA,重组，,获得高效表达产物。,理想的表达载体应当是：高拷贝数，具有强启动子和稳定的,mRNA,，具有高的分离稳定性和结构稳定性，转化频率高，宿主范围广，插入外源基因容量大而且可以重新完整地切出，复制与转录应和宿主相匹配，最好是可调控的，而且在宿主不生长或低生长速率时仍能高水平地表达目的基因。,