实验七-植物DNA的提取与纯度鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验目的,实验原理,实验材料,实验试剂,实验仪器,实验步骤,注意事项,实验目的,了解植物总DNA提取的原理,学习和,掌握,提取、纯化高等植物总DNA的方法和步骤,核酸的理化性质,DNA,和,RNA,都是极性化合物，一般都溶于水或,1mol/L,的,NaCl,溶液中，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。核酸的钠盐比游离酸易溶于水，,RNA,钠盐在水中溶解度可达,40g/L,。,DNA,在水中为,10g/L,，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，,DNA,、,RNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,天然状态的,DNA,是以脱氧核糖核蛋白,(DNP),形式存在。,DNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。,DNP,在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在,0.14 mol/L,的氯化钠中溶解度最低，仅为在水中溶解度的,1%,，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至,1mol/L,氯化钠中的溶解度很大，比纯水高,2,倍。,背景知识 1,背景知识 4,不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。,提醒,真核细胞基因组提取的方法,浓盐法,离子去污剂法,苯酚抽提法,水抽提法,CTAB法,DNA,提取基本方法：,1.机械法破碎细胞,2.去除蛋白质，酚类等细胞内杂质污染,3.纯化,CATB法的简析,冷冻和研磨，使细胞破裂,加入CTAB提取缓冲液，溶解DNA,氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白,加入无水乙醇/异丙醇，沉淀DNA,酒精冲洗，去除剩余杂质,RNase消化，去除RNA,无菌水/TE溶解，保存DNA,CTAB法实验原理,离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为,CTAB,)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称,SDS,)等,可以有效裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。,具体,CTAB、SDS等离子型表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚/氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇/无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE或水溶液中，即得植物总DNA溶液。,实验材料,烟草嫩叶,实验仪器和设备,研钵、研棒、水浴锅、高速冷冻离心机,移液器及配套吸头、50ml10ml量筒,1.5ml离心管,、,50mL离心管,实验试剂及其配置,CTAB,抽提液（,要求配,100mL,）,实验试剂及其配置,2 1 M pH 8.0 TrisCl（,已有不用配置,）,121 g Tris碱溶于800 mL dd H2O，浓HCl调pH至8.0，补dd H2O定容至1000 mL。,注意：Tris缓冲液的pH值随温度变化较大，每1可引起大约0.028 pH单位的变化。,实验试剂及其配置,0.5 M pH 8.0 EDTA(,乙二胺四乙酸,),（,要求配,100mL,）,29.22 g EDTA,溶于,140,mL,水中，用固体,NaOH,调,pH,至,8.0,，补,ddH2O,定容至,200,mL,。,作用：,EDTA,螯合二价离子，抑制,DNA,酶的活性，保护,DNA,实验试剂及其配置,CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7 M NaCl),（,要求配,50mL,）,CTAB 20 g,NaCl 8.2 g,加入,160 mL ddH2O,，加热至,65,溶解，补,dd H2O,定容至,200 mL,，高压灭菌。,注意：此溶液很粘稠，使用时需加热至,65,。,实验试剂及其配置,5 3 M NaAC pH 5.2,（,要求配50mL,）,81.62 g NaAC3H2O/49.22 g 无水NaAC溶于160 mLddH2O中，冰乙酸调pH至5.2，定容至200 mL，高压灭菌。,作用：Na离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，使沉淀更完全。,实验试剂及其配置,6 高盐TE溶液（pH 8.0）,（,要求配50mL,）,作用：DNA保存更稳定,实验试剂及其配置,7 24：1的氯仿（三氯甲烷）/异戊醇,（,要求配50mL,）,氯仿变性蛋白质，异戊醇消除气泡,注意：混匀过程要轻柔，以免DNA断裂。,8,75%乙醇,（,要求配50mL,）,实验步骤（1）,1、CTAB抽提液65预热；异丙醇20预冷；,2、称取新鲜烟草叶片1克，加液氮研磨，共加3-4次液氮；,注意：,(1)研磨时应注意防止液氮冻伤，戴上一次性PE手套；,(2)新鲜的本氏烟较易磨碎，加液氮3-4次；杂草样品特别是不新鲜的杂草样品常较难磨，加液氮4-5次。一般加液氮4次；,(3),加液氮时动作轻柔，否则液氮会将样品冲出而造成样品损失,；,(4)磨样过程中，样品不能溶化，样品研磨得越细越好；,(5)每换一个新样品，要换一次PE手套。,实验步骤（2）,3,、最后一次加液氮磨样后，立即加入预热的CTAB抽提液，每克叶片加入8 mL CTAB抽提液，再加入160,L 2巯基乙醇（2-Me）（终浓度2（v/v）。继续研磨待CTAB抽提液溶化后，将研磨液转入50 mL离心管；,4、65水浴锅温浴0.5-1小时，每10-20分钟摇动一次离心管；同时65预热CTAB/NaCl；,注意：离心管盖子应轻轻搭在管口，,千万不能盖紧，以防加热使盖子冲出,，最好离心管壁和盖子同时做好标记。,实验步骤（3）,5、加入等体积（约8 mL）24：1的氯仿/异戊醇抽提；,注意事项：,（1）氯仿/异戊醇有毒，应戴上PE手套操作且保持室内通风。,（2）1 mL移液枪吸取氯仿/异戊醇时，应缓吸缓放，严禁枪头朝上以防氯仿/异戊醇倒灌进枪管而腐蚀枪杆。,（3）加入氯仿/异戊醇，盖紧盖子，按紧离心管两端，上下颠倒4-6次，,松手后立即打开盖子，防止管内液体冲出,。,实验步骤（4）,6、天平平衡离心管，4 10000 rpm 离心5分钟；,7、回收水相，将上清小心地转入另一50 mL离心管（约8mL）；,注意事项：水相底部有大量杂质，用移液枪转移水相时应细致耐心，不能吸入杂质；,8、加入1/10体积（800,L）、65预热的CTAB/NaCl，混匀。,CTAB/NaCl 较粘 稠，可将枪尖剪去后吸取；,9、加入等体积（8 mL）氯仿/异戊醇二次抽提，注意事项同步骤5；,10、平衡离心管后，4 10000 rpm 离心5分钟；,实验步骤（5）,11、回收水相，将上清小心地转入另一50 mL离心管（约8mL），注意事项同步骤7；,12、加入1/10体积（800,L）3 M NaAC，混匀；,13、加入等体积（8 mL）20预冷的异丙醇，20放置0.5-1小时；,14、4 12000 rpm 离心15分钟；,15、弃上清，2 mL 75乙醇洗涤沉淀一次；,实验步骤（6）,1、12000 rpm 离心2分钟，轻轻地吸出75乙醇，将离心管反扣在干净的吸水纸上将乙醇吸干；,注意：枪头不要吸到沉淀,1、37 烘干10-15分钟；,注意：DNA烘干过程中应注意观察，以DNA较饱满且四周见不到明显的水滴为宜，如DNA呈纸状贴在管壁上，则烘干过分，会造成DNA难以溶解；,1、加入200-500,L 溶液溶解；,注意：如DNA难溶，可37水浴数分钟；,实验步骤（）,、加入2,L RNAase（10,g/,L）34,L，混匀，37水浴消化30分钟；,注意：所提DNA可用于Southern杂交，如仅用于PCR扩增，此步骤可省；,2、DNA 纯度鉴定,植物DNA的纯度鉴定,提取得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量,原理：核酸在260nm处有最大吸收峰,蛋白质在280nm处有最大吸收峰,盐和小分子在230nm处有最大吸收峰,OD,260,/,OD,280,=1.7-1.9,OD,260,/,OD,230,2.0,1OD,260,=50,g/mL DNA,2.0样品中污染RNA，或DNA降解,植物DNA的纯度鉴定方法（1）,1.DNA溶液稀释20-30倍后，,紫外分光光度计,测定OD260/OD280 比值,明确DNA的含量和质量；,2.取2-5l 在0.%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小；,DNA,样品在0.8%Agarose胶上电泳（例图）,植物DNA的纯度鉴定方法（2）,植物DNA的纯度鉴定方法（3）,3.取2g DNA,用10单位Hind酶切过夜,0.7%agarose胶上电泳,检测能否完全酶解（做RFLP，DNA必须完全酶解）。,如果DNA中所含杂质多，不能完全酶切，或小分子DNA多，影响后续的分析和操作，可以用下列方法处理：,（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量；,（2）酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖；,（3）柱子过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA；,（4）氯化铯梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA（可用作文库构建）。,凝胶电泳鉴定植物DNA的纯度,取2-5l 在0.%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小及纯度,1 每组配制0.%agarose胶1块；,2 取3ul DNA抽提液上样，电泳半小时；,3 紫外下观察结果,试验要求,THE END,