干细胞研究进展.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,干细胞研究进展,医学院病理生理教研室,欧阳静萍,2004.11,临床病理生理学,干细胞,干细胞（,Stem,cells,SCs,）,来自胚胎、胎儿或成人的具有持久或终身自我更新能力的细胞，它能产生特异的细胞类型，形成人体组织和器官,特征,圆形、椭圆形，体积小、核大，具有较高的端,粒酶活性,特点,它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；,它们可无限地分裂产生大量后裔,;,其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞,干细胞的特点,多向分化,分化,（,Differentiation,）,指非特化细胞,(,如干细胞,),成为组成身体的诸多的细胞中的一种特定细胞的过程,可塑性,一种成体干细胞生成另一种组织细胞的能力,自我更新,成体干细胞制造自己本身,干细胞分类,全能干细胞,：,Totipotent stem cell,如受精卵,多,能干细胞,：,pluripotent stem cell,，如囊胚中的内囊细胞,专能干细胞,：,multipotent stem cell,，,如造血干细胞,根据供体组织所处的发育时期不同分,胚胎期干细胞,ESCs,EGCs,成体干细胞（,Adult Stem,Cells，ASCs,）,是一种具有自我更新能力的未分化细胞,来源:,骨髓、血液、眼睛的角膜和视网膜、脑、骨胳肌、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠道上皮、胰腺和间充质干细胞（,Mesenchymal,stem,cells，MSCs,）,分类,来源,干细胞类型,可分化细胞,胚胎 干 细胞,畸胎瘤,胚胎干细胞（,EC),各种类型组织细胞,胚胎内胚团,胚胎干细胞（,ES),胚胎生殖脊,胚胎生殖细胞（,EG),成体干细胞,脑组织,神经干细胞,神经元、血细胞,成熟骨髓组织,造血干细胞,血液细胞、神经胶质细胞,间充质干细胞,肌、骨、肌腱、韧带,根据其来源组织不同而分,造血干细胞,神经干细胞,胰腺干细胞,骨髓干细胞,脂肪干细胞,美国,SCIENCE,1999年度,年度世界十大进展之榜首,胚胎干细胞,存在于受精后约5-7天人胚胎的囊胚内细胞团,具有分化为机体任何一种组织器官的潜能,具有种系传递功能,在体外可以进行遗传操作,胚胎干细胞,1998年11月美国威斯康辛大学,Thomsan,报道获得人胚胎干细胞株,传代超过8个月、32代,在体外长期保持增殖和未分化状态,怎样得到,pluripotent stem cell?,1998,年美国有两个小组分别培养出了人多能,(pluripotent),干细胞：,James A.Thomson,：,Wisconsin,大学,方法：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取,inner cell mass,细胞，建立细胞株。测试细胞株的细胞表面,marker,和酶活性。每个胚胎可取得,15,20,个细胞用于培养。,John D.Gearhart:,Johns Hopkins,大学,方法：从受精后,5,9,周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞,(primordial germ cell),。由此培养的细胞株，证实具有多能干细胞的特征。,A.Inner cell mass-derived cells,B.H9 colony,C.H9 cells,D.Differentiated H9 cells,干细胞培养过程,干细胞和前体细胞的分化,Rosettes of neural epithelium.Cell line H14,.,Bone.Cell line H14.,Striated muscle.Cell line H13.,Cartilage.Cell line H9.,胚胎干细胞的表面标志,胚胎阶段特异性抗原,（,SSEA-1、3、4）,TRA-1-60,TRA-1-81,碱性磷酸酶,A.,Alkaline phosphatase,B.SSEA-1,C.SSEA-3,D.SSEA-4,E.TRA-1-60,F.TRA-1-80,人类胚胎发育简图,小鼠胚胎发育简图,胚胎干细胞分化,人类胚胎干细胞研究的重要性,生物学与医学基础研究：,人类干细胞是机体早期发育的极好模型。人类发育生物学研究经常受到伦理学的限制。胚胎干细胞提供了直接研究早期发育出现的复杂事件和细胞分化的原初过程。,关键是找到控制与发育和分化过程相关特定的因子,为了解非正常细胞分化（肿瘤等）的原因提供线索,医疗实践,细胞移植,药物设计,成体干细胞,成体干细胞是否具有胚胎干细胞那样的分化潜力？,大量的动物实验证明了成体干细胞具有很强的分化能力：,成年小白鼠未发育的脑干细胞转变为肌肉细胞,成年人志愿者的神经干细胞实现了同样的工作,是干细胞研究中最激动人心的部分。它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面的争论。,成体干细胞,存在于成熟个体各种组织器官中,可分化为相应组织,可分化为其它组织器官,在人体发育的过程中，成体干细胞为存留在多种组织中且具有多系分化能力的亚全能干细胞群体。,影响成体干细胞应用的某些因素,当前并没有在所以人体组织中发现成体干细胞；,成体干细胞含量极少，很难分离与纯化；,对某些病人来说，可能：,疾病的进程等不到足量干细胞的培养；,病人自身基因组有遗传缺陷；,骨髓干细胞,造血干细胞,：,红系、髓系,基质干细胞：,具有多向分化潜能,成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞,网状细胞,肌细胞,造血干细胞,存在于造血组织内的一类能分化发育成各种血细胞的原始细胞,出生前:存在于肝脏,出生后：存在于红骨髓内，5有核细胞,少量存在于脾脏、淋巴组织、外周血中,骨髓干细胞的定向分化简图一,骨髓干细胞的定向分化简图,造血干细胞的表面标志,CD34,抗原,Thy1,表面抗原,Ckit,表面抗原,Lin,抗原：,CD11、13、15、16（,粒系）,CD14（,单核系）,CD11、25、7、56（T/NK,系）,CD19、20、21、45（B,淋巴系）,CD47、59、71（,红系）,CD31、41、61、63、107（,巨核系）,Rh-123,荧光,4,HT/5FU,抗性,A.CD34 localizes to endothelial cells,研究现状,骨髓、脐血、外周血移植技术成熟,将基因导入造血干细胞治疗疾病,水平与国际同步,骨髓：造血干细胞 基质,基质,:,无成骨性细胞,:,脂质细胞、网状细胞、内皮细胞和 成纤维细胞,间充质细胞,：骨髓血系细胞起支持诱导作用,表面标志,碱性磷酸酶,(AKP),阳性,:,甲状旁腺素抑制,VitD3,促进，,表面特异受体：,CD44,不具有造血系细胞独有的,CD14,、,CD34,和表面受体存在特异性,16(,如,CD4417),，不具有造血系细胞独有的,CD14,、,CD34,和,CD45,等表面抗原,CD45,数量和特点,传代后以每两天倍增一次的速度扩增，这种几何级数的扩增能持续,10,代左右,8,。而且随着细胞的增殖，其细胞性状和分化潜能并不会改变和丧失,间充质干细胞,存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，具有支持造血、多向分化潜能,形成于发育中的骨髓腔,出生后附于骨髓窦的内腔面,（占细胞总数的0.1-0.01）,可分化为：骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基质、软骨,间充质干细胞的,分化,神经干细胞,中枢神经系统中具有自我更新及,分化成成熟脑细胞的能力的细胞,可分化为:星形胶质蛋白,少突状细胞,神经细胞,应用前景,移植修复受损神经,“有前途的”脑癌治疗新手段,判断药物有效性、毒性神经元,神经干细胞表面标志,Ten bone marrow-derived cells coexpressing both TuJ1 and NF-H(*),Tubulin,NF-H,研究现状,分化条件,GGF,雪旺氏细胞,BMP-2，4,促进发育,T3,少突胶质细胞,临床应用,帕金森氏病成活10年以上,无排斥反应,不具成瘤性,NSC,的分布,胚胎期神经系统：,大脑皮层、海马、纹状体、嗅球、脑室沿线包括侧脑室、第三脑室和第四脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜,成体哺乳动物中枢神经系统：,两个,NSC,聚集区,:,侧脑室壁的脑室下层,海马齿状回的颗粒下层,NSC,的生物学特性,缓慢的自我增殖能力,：短暂的增殖期,过渡放大细胞,再经过若干次分裂后产生分化细胞,有利于干细胞对特定的外界信号作出反应,减少基因突变的危险,自稳定性,：生命区间中自我更新并维持其自身数目的恒定。此过程通过两种方式实现,对称分裂,:,干细胞分裂产生的两个子细胞都是干细胞,;,不对称分裂,:,。,处于高度未分化状态,:,呈中间纤维抗原巢素蛋白,(nestin),阳性,而缺乏已分化细胞的抗原标志。,具有多向分化潜能：,可诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少,突胶质细胞三种主要神经组织成分。,可发生转分化和去分化,NSC,的增殖分化机制,需要多种活性因子的协同作用,EGF,、,PDGF,、,CNTF,、,BDGF,、,IGF,基因表达调控,NSC,的分化,Delta-Notch,信号通路,Notch,激活 干细胞增殖,Notch,抑制 干细胞分化,永生化：,基因工程技术导入外源性癌基因,诱,导干细胞的细胞周期不断循环往复,阻止细胞分化过程,从而,NSC,获得永生,临床应用,细胞替代治疗：,移植入新生期和成年大鼠脑内,整合到嗅泡、纹状体、皮质、小脑。分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。,修复神经元缺失 修复损伤的神经胶质,治疗神经系统退行性疾病：帕金森病,(PD),、阿尔茨海默病,(AD),和亨廷顿病,(HD),方法,：,诱导病变部位本身神经干细胞 增殖分化,从患者体内分离神经干细胞，体外增殖和加工，再移植到相应的病变部位。,永生化神经祖细胞具有能整合,外源基因载体,转染报告基因,(,如,LacZ,基因,),转染神经营养因子的基因,(NGF,转染神经递质合成酶,(,酪氨酸羟化酶,),基因,用于治疗帕金森病,表皮干细胞,定位,：,胎儿时期 初级表皮嵴,成人 表皮基底层细胞,毛囊的膨胀部位,表面标志：,integrin,A.,无发囊表皮，干细胞位于基地底层,B.,发囊，干细胞位于膨胀部位,典型特征,慢周期性,(slow cycling),：如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达,2,年,;,干细胞的自我更新能力：,表现为在离体培养时细胞呈克隆性生长,如连续传代培养,细胞可进行,140,次分裂,即产生,1 1040,个子代细胞,;,对基底膜的粘附：,干细胞主要通过表达整合素实现其对基底膜的粘附。,分化的调控,细胞因子：,白细胞介素,(ILs),干细胞生长因子,(SCF),表皮细胞生长因子,(EGF),成纤维细胞生长因子,(FGF),肝细胞生长因子,(HGF),干细胞“壁龛,(Niche)”,干细胞壁龛即干细胞生存的微环境,保持干细胞的生理状态、维持干细胞未分化的特性,同时也起到信号传导作用,。,表皮干细胞壁龛：,上覆有黑素体,以免除紫外线对干细胞的损害,下连富有局部高密度血管的真皮,为干细胞提供丰富的血液。,细胞之间存在许多缝隙连接,(gap junction),：,为信息通道,规范着表皮干细胞群落的分化方法,肝干细胞,来源：,内源性肝脏干细胞,：,存在于肝脏内具有增殖分化为肝细胞和胆管细胞的能力的一类细胞,外源性肝脏干细胞,骨髓源性干细胞,Alison,等,(2000),：接受男性骨髓移植的女性患者体内出现了男性肝细胞。,Lagasse,等报道,仅用小部分纯化的造血干细胞就可使急性肝衰竭大鼠的肝脏迅速恢复,胰源性干细胞,肝干细胞的表面标志,肝脏干细胞和肝病的研究进展,1.,肝脏干细胞在肝损伤中的作用,:,肝干细胞在肝脏修复损伤的过程中具,有重要临床意义。一般认为肝细胞增,生性反应可分为,:(1),代偿性增生或再,生,;(2),肝细胞过度增生,;(3),干细胞增,生。其中肝干细胞增生具有特定的临,床研究价值,肝脏干细胞和原发性肝癌的关,系,:,肝脏干细胞应用前景,肝脏干细胞基础研究,:,阐明肿瘤的发生机制,肝脏干细胞移植研究,:,能双向分化成肝细胞、胆管上皮细胞,可替代受损肝细胞功能,刺激肝组织增生,肝脏干细胞移植的部位,；,腹腔内移植、静脉移植、脾内移植、门脉或肝内移植,干细胞分化的调控,内源性调控,结构蛋白 多肽因子 端粒体酶,外源性调控,TGF PDGF LIF,细胞膜表面分子,Notch,信号,整合素,干细胞与心脏,心脏疾患的治疗,修复缺血或损坏的心肌,使心肌细胞再生,骨髓基质干细胞,加入,5-,氮杂胞苷,azacytidine,),培养,24 h,自发跳动 加入,5-,氮杂胞苷培养,24 h 30%,自发跳动细胞 合成心房肽和脑钠肽,骨髓干细胞注射到心肌梗死区域的交界处,发现梗死部位有,68%,为新生心肌细胞,转入细胞因子,VEGF,：促进新生血管形成,VEGF,基因转入,ES,细胞,使,ES,细胞稳定表达,VEGF,。这种转基因的,ES,细胞在体外诱导分化后移植到梗死的心脏,显著增强心脏收缩力,。,干细胞治疗心肌梗塞（一）,干细胞治疗心肌梗塞（二）,需解决的问题,研究心脏分化的机制,使,ES,细胞能高效地分化为心肌细胞,;,需要有效的大规模培养、筛选技术,以得到能应用于临床的大量细胞,;,进行细胞移植的动物实验,尤其是大动物,;,有效解决免疫排斥问题,;,ES,细胞能在体内产生畸胎瘤,其安全性需进一步研究。,骨髓干细胞动员,循环干细胞,(circulating stem cells,CSCs),骨髓基质干细胞经静脉移植后,首先回到骨髓中,然后进行正常的生理循环,作为间质组织前体细胞来源,参与组织的修复工作,损伤时机体这种自发性的,CSCs,数量增加可以进行损伤修复,骨髓干细胞动员,骨髓释放干细胞到外周血的现象。,动员剂：,粒细胞集落刺激因子,(G2CSF),粒巨细胞集落刺激因子,(GM2 CSF),血管内皮生长因子,(VEGF),基质源性生长因子,21(stromal2derived factor21,SDF21),CSCs,修复损伤心肌,骨髓（表达绿色荧光蛋白,(GFP),转基因小鼠）移植受体鼠（致死量照射）,5,周后,GFP(+),结扎受体鼠左冠状动脉 心肌梗死处可见,GFP(+)MSCs,并分化为心肌细胞,（,68%,的梗死部位）,（,2001,年,Orlic,）,干细胞的归巢,：,干细胞因子,(stem cell factor,SCF),SDF-1,可以迅速趋化干细胞的定向迁移,必备条件：,新近靶器官受损,;,循环,MSCs,数量足够多,存在问题,有许多技术和理论问题尚不清楚,;,治疗对象的选择问题,;,治疗急性心肌梗死的有效治疗窗不明确,;,尚无大规模临床试验证实其真正的疗效,;,骨髓干细胞动员最佳程度问题,;,更加特异性的动员剂研制,成体干细胞的置疑,2002,年,4,月起,Nature Science,连续发表成体干细胞横向分化的“可塑性”的置疑文章,骨髓细胞在体内不能横向分化为神经细胞,成年干细胞发育“可塑性”证据不足,骨髓细胞在体内不能横向分化为神经细胞,Science,2002.8,供体：,Rosa26,小鼠 表面标志,LacZ,受体：,B6,小鼠,移植后：,B6,小鼠,80-95,的白细胞表达,LacZ,中枢神经系统均不表达,LacZ,（含受伤部分）,结论：不能横向分化,美国贝尔医学院,成年干细胞发育“可塑性”证据不足,Science2002.9,斯坦福大学,Weissman,教授,单一标志骨髓基质细胞：,GFP,结果,非造血系统均未发现表达,肝细胞内,1/70000,孤立出现,结论,：,横向分化即使发生也极为罕见,原因,成年肝细胞与,ES,细胞融合 成年组织中余存一定数量的胚胎样干细胞,前景,过分的狂热和不理智,不意味着干细胞疗法的终结,更严谨、更科学的研究,干细胞的信号通路,肿瘤干细胞,是一些极少的具有自我更新不定潜能的驱使肿瘤形成的细胞。,与正常干细胞具有相似的信号调节通路,存在的证据,白血病细胞移植给同品系小鼠，,1-4,细胞具有成瘤性,干细胞分化受阻,皮肤癌：,起始于生命早期，症状出现在生命中晚期发生,表皮细胞到角质细胞极易被清除,表皮干细胞可静止数年,已分离的肿瘤干细胞,乳腺癌肿瘤干细胞,乳腺癌标本 单细胞悬液 流式细胞仪分选,CD44,、,B38.1,、,ESA,细胞。,具有成瘤性,白血病干细胞：,CD34,CD38,肿瘤干细胞,干细胞分化的的调控,指给出适当的条件，对干细胞的增值和分化进行调控，使之向指定的方向发展,内源性调控,：,细胞骨架成分,膜收缩蛋白、细胞周期素,A,转录因子的调控,转录因子,Oct4,白血病抑制因子,（,LIF,）,Tcf/Lef,转录因子家族,外源性调控,（,1,）分泌因子,TGF,家族和,Wnt,信号通路,胶质细胞衍生的神经营养因子（,GDNF,）,Wnts,的作用机制是通过阻止,-Catenin,分解从而激活,Tcf/Lef,介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的,Wnt,信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。,膜蛋白介导的细胞间的相互作用,有些信号是通过细胞,-,细胞的直接接触起作用的：,-Catenin,：介导细胞粘附连接的结构成分。,穿膜蛋白,Notch,及其配体,Delta,或,Jagged,在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，,Notch,信号都起着非常重要的作用。当,Notch,与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当,Notch,活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞,整合素（,Integrin,）与细胞外基质,整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。,当,1,整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。,研究方向,细胞系的建立,组织和器官培养,基因治疗,干细胞研究遇到的问题,如何有效的诱导干细胞定向分化,如何在体外发育成一完整的器官,如何克服排斥反应,如何解决干细胞向癌细胞发展,解决免疫排斥问题,建立含多种,MHC,基因型干细胞库,建立经遗传改构的通用型干细胞系（在小鼠已获初步成功）,将受者全部基因转移给干细胞,定做一个与受者同型的干细胞,干细胞研究的意义,发现新的人类基因,发现不同基因在生命活动中的功能,新药的发现及筛选,修复甚至替换丧失功能的组织和器官,干细胞和基因组研究,生物学领域两项新进展的结合,2000,国际十大科技成果：,基因组,干细胞,这两项研究就结合在一起了,干细胞是功能基因组研究的最佳选材,是各种不同组织和细胞类型的共同的源,可代表个体发育的各个阶段,;,是人体材料但很少涉及伦理学和法律学问题；,具有重要的应用价值。,干细胞工程,核移植,去核胚胎干细胞,组装胚胎干细胞,组织干细胞,各种组织器官,体外诱导培养,干细胞技术的市场前景,低毒性（或无毒性），一次药有效；,不需要完全了解疾病发病的确切机理；,还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。用干细胞治疗疾病已不再只是设想,体外制造人体器官,角膜,血管,皮肤,软骨,韧带,心脏,神经,长生不老的希望,目前科学家已能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。假如 在 年老时能使用上自己或他人婴幼儿或青年时期采集保存的干细胞及其衍生组织，那么人类长期追求的长生不老和幻想就有可能成为现实。,造血干细胞移植是目前治愈白血病和某些遗传性血液病的惟一希望,在肿瘤和难治性免疫疾病的治疗中也有其独特的作用。,著名发育学家,Zon,Nature2000.12.28,“,对于干细胞科学，我们还处在黑暗的年代,（,the Dark Ages,）”,谢谢,