生物分离与纯化技术(生化工艺)第7章-色谱分离技术.ppt

*,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,国家精品课程生物分离工程,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2025/11/4 周二,第,1,节 色谱分离技术基础,一、色谱技术的基本概念与基本原理,概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱均含有,固定相,和,流动相,，根据物质在两相间的,分配行为不同,，,经过多次分配,（吸附,-,解吸,-,吸附,-,解吸,），不同物质在流动相与固定相中的分配不同而迁移速率不同，从而达到分离的目的。,固定相：,在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。,流动相：,与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的一相,2025/11/4 周二,色谱分离技术的特点,特点：,（,1,）,纯化倍数高,（,2,）操作规模小，放大困难,（,3,）终产品纯化,（,4,）操作成本高、适用于价格昂贵的产品,2025/11/4 周二,色谱分离的基本原理,任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相流动而迁移的过程，不同溶质在流动相和固定相中的分配比例不同，因而随流动相迁移的速度不同，从而使不同物质分离开来。,2025/11/4 周二,二、色谱的分类,根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶过滤法,分配色谱法,离子交换色谱分离法,吸附色谱法,疏水作用色谱分离法,金属螯合色谱分离法,共价作用色谱分离法,物理吸附色谱分离法,2025/11/4 周二,二、色谱的分类,根据固定相的填充形式不同的分类：,柱层析法,薄层层析法,2025/11/4 周二,二、色谱的分类,根据流动相的物态不同的分类,：,液相色谱,反相色谱：,固定相极性小于流动相,根据流动相与固定相的极性分类,：,正相色谱：,固定相极性大于流动相,气相色谱,2025/11/4 周二,三、色谱系统的基本组成,2025/11/4 周二,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,一、吸附色谱的原理,吸附色谱是以吸附剂为固定相，洗脱液为流动相的色谱分离操作。,混合物中不同的物质极性不同而使得吸附剂对其吸附的强度不同，极性不同的物质在固定相（吸附剂）和流动相（洗脱剂）分布不同，所以洗脱时迁移速率不同而实现对混合物的分离。,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,二、吸附色谱填料,1.,硅胶,硅胶表面有大量的硅醇基团，能吸附很多水分子，加热至,100,以上可除去水，,500,以上硅醇结构被破坏，硅胶失去活性；,硅胶属于极性的吸附剂，对极性大的物质吸附能力强，难洗脱；,硅胶呈微弱的酸性，不适合碱性物质的分离,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,二、吸附色谱填料,2.,氧化铝,氧化铝有酸性、中性及碱性氧化铝分别适合在酸性、中性、碱性条件下使用。,氧化铝是极性吸附剂，其活性与含水量有关，含水量大则活性低，氧化铝层析剂一般是在,400,处理一段时间失水形成的。,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,二、吸附色谱填料,3.,大孔树脂,大孔树脂是一类人工合成的聚合物吸附剂，分为强极性、中等极性和弱极性树脂，一般弱极性和中等极性树脂用得较多；,大孔树脂特点：解吸附容易、选择性好、耐用、适用广泛。,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,三、吸附色谱操作,1.,薄层吸附色谱（氧化铝和硅胶薄层层析）,制版：将层析剂用乙醇调糊，用涂布机涂布于玻璃平板上，经烘干处理即可；,点样：,点小、加样量适中、溶剂易挥发,展开：选择合适的展开剂盖上层析缸盖子,显色：碘蒸气、紫外、化学试剂喷雾显色,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,三、吸附色谱操作,吸附柱色谱（硅胶）,层析剂预处理：,浓盐酸浸泡硅胶,6,12,小时，然后用蒸馏水洗涤硅胶,3,4,次，将起进行减压抽滤，后不断加蒸馏水冲洗。在,1,小时之后，抽滤的水呈中性，晾干后，在,110,烘箱中活化,2,小时。,2025/11/4 周二,第,2,节 吸附色谱,三、吸附色谱操作,吸附柱色谱（硅胶）,装柱：将处理好的硅胶用适当溶剂搅拌均匀，一次性装入层析柱,。（柱上端平整、均匀、严实、无气泡）,平衡：用洗脱溶剂洗至基线平稳,上样：,洗脱：同薄层展开剂,2025/11/4 周二,第,3,节 离子交换色谱,一、离子交换概述,离子交换过程的本质及选择性,离子交换是离子交换剂上的反离子电离至水溶液中而溶液中其他与固定电荷带有相反电荷的离子通过静电吸引力而被吸附在固定电荷，其本质上是一个可逆化学反应（平衡反应）。,不同离子交换反应平衡常数不同，因而荷点溶质分配在离子交换剂与水溶液中的比例不同,2025/11/4 周二,第,3,节 离子交换色谱,一、离子交换概述,影响离子交换选择性的因素,（,1,）离子电荷数（化合价）,（,2,）离子水合半径,（,3,）离子电荷强弱,2025/11/4 周二,第,3,节 离子交换色谱,二、离子交换色谱原理,离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，洗脱液为流动相的色谱分离操作，由于不同物质电荷性质、数量、强弱等不同，因而与离子交换剂的固定电荷静电吸引力不同，使得其在固定相、流动相分配不同，因此迁移速率不同而实现对混合物的分离。,2025/11/4 周二,第,3,节 离子交换色谱,三、离子交换色谱操作,离子交换剂预处理,阴离子交换剂：,酸碱酸,或,碱酸,阳离子交换剂：,碱酸碱,或,酸碱,对于疏水载体骨架构成的离子交换剂应先用乙醇浸泡，再用水稀，然后再采用相应的酸碱处理,装柱、上样、洗脱基本与吸附色谱相同。,2025/11/4 周二,第,4,节 凝胶色谱,一、凝胶色谱原理,凝胶色谱所用的层析剂是一类无吸附能力的多孔凝胶颗粒，多孔颗粒孔隙内的溶液为固定相，颗粒间隙中的溶液为流动相，由于不同分子大小不同而在颗粒内外分布不同，因此洗脱速度不同而实现对分子大小不同的混合物分离。,2025/11/4 周二,第,4,节 凝胶色谱,二、凝胶色谱的用途：,蛋白纯化、脱盐、去除小分子,优点：操作方便、分离迅速、,不影响生物活性,三、层析剂,葡聚糖凝胶：,sephadex G-10/50/75/100/200,琼脂糖凝胶：,sepharose(CL)2B/4B/6B,聚丙烯酰胺凝胶：,Bio-Gel P-2/4/6/10/30,选择凝胶主要注意其,分离范围,2025/11/4 周二,第,4,节 凝胶色谱,四、凝胶色谱操作,凝胶预处理,称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。,装柱,加样与洗脱,凝胶柱的重复使用与保存,用完后，以水冲洗，然后用,60%70%,酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存,