流式细胞检测技术讲座.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞技术原理及其在临床,&,科研中的应用,（,Flow Cytometry,FCM),北京利文商贸有限责任公司,李建廷,主要内容,流式细胞技术概念,流式细胞技术原理,流式实验的设计,流式细胞技术在临床,&,科研上的应用,流式细胞技术概述,流式细胞技术的概念,流式细胞技术的特点,流式细胞仪的检测范围,BD,公司流式细胞仪,流式细胞仪的结构,什么是,FCM,？,流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术,激光技术,+,流体力学,+,光电测量技术,+,计算机技术,+,细胞荧光化学技术,+,单克隆抗体技术,FCM,的特点,测量速度快：最快可在,1,秒种内检测上万个细胞,可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量,具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况,高分辨率,(CVPEPerCP-Cy5.5FITCPerCP,4.,抗原密度,高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原（如细胞因子）则需要用较高,S/N,比值的荧光素（如,PE,和,APC,）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。,如血小板活化检测试剂：,PAC-1-FITC/CD62P-PE/CD61-PerCP,荧光抗体组合的选择,5.,荧光光谱之间的重叠,在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠的影响，但使用荧光探针的种类越多，补偿的复杂程度增加，因此选择光谱重叠越少的组合越好,6.,自发荧光,每个细胞群体的自发荧光水平都不同，自发荧光在高波长范围里（,600nm,）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如,APC,），可得到较好的,S/N,比,7.,荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性,/,假阳性结果,一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。尽量选择同一家公司的试剂可以减少干扰。,常用荧光染料组合,FITC,PE,：最常用的双色组合,FITC,PE,PerCP,：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小，但,PerCP,光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上，如,CD4/8/3,FITC,PE,PerCP+APC,：最常用的四色组合，一般,PE,和,APC,用于检测表达较低的抗原上，而,FITC,和,PerCP,用于检测表达较高的抗原上，如,CD3/8/45/4,PerCP-Cy5.5,与,PE,之间的重合光谱范围很小，也可用于四色组合,PE-Cy7,可与,FITC,、,PE,、,APC,标记的抗体一同使用，荧光补偿小,PE-Cy5,可与,FITC,、,PE,同时使用，但不能与,APC,同时使用，二者之间荧光干扰太大,PE-Texas Red,尽量不与,PE,同时使用，二者之间荧光补偿非常大,临床上常见的流式检测项目，所需的试剂组合基本都有参考或推荐的抗体组合，如：,血小板活化检测：,造血干细胞计数：,但对于白血病,/,淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止尚没有统一的抗体组合,常用单抗组合,荧光抗体,PE,FITC,或,PerCP,对照管,IgG1,CD45,试验管,CD34,CD45,荧光抗体,FITC,PE,PerCP,对照管,PAC-1+RGDS,IgG1,CD61,试验管,PAC-1,CD62P,CD61,小结,单细胞悬液（组织分离过,200,目滤网，上机前过,300-400,目滤网）,尽可能减少死细胞（比例根据实验决定，一般,5%,）,染色前细胞计数,每管细胞数为,10,6,，体积,0.5-1mL,根据抗原特性及实验目的选择抗体组合,设补偿对照和同型对照,补偿对照每次实验设置，同型对照每个实验重复都要设置,低频细胞及,FcR,表达丰富的细胞要使用,FcR,阻断剂,仪器要求尽可能的干净,有死细胞时单色分析需要补偿,