激素及其检测技术.ppt

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,食品中激素问题的由来,为促生长或改善胴体质量，上世纪,70,年代后瘦肉精开始在动物饲养中使用，其后莱克多巴胺、沙丁胺醇等,2,受体激动剂和拟交感神经剂陆续出现在动物饲养中；国外同时期也使用蛋白同化激素后被大部分国家禁用；国内饲养业出现的主要问题为雌激素,/,孕激素在水产品中的使用，蛋白同化激素使用没有可靠数据证明，但个别内源属性同化激素的异常水平原因不清,上世纪,80-90,年代兴奋剂滥用出现在中国的竞技体育中，其中最主要的药物具有甾体结构的蛋白同化激素，主要以药物滥用为主，也有经保健食品摄入,糖皮质激素和部分合成类固醇如诺龙,(,nandrolone,),一直是动物临床合法使用的药物，饲养动物疫病的增加以及饲养业为防病的目的,不科学的使用,/,滥用,导致残留,原料药市场疏于监管，饲料业监管不力,功能性食品、保健品、中成药人为添加激素、类激素,(,原料药、各研发阶段药物,/,相似结构化工产品,);,2,激动剂和拟交感神经剂,受交感神经,/,副交感神经支配的器官,/,腺体如,心脏、气管,/,支气管、肺、肠、肝、肾上腺等，存在着能够与,肾上腺素,/,去甲肾上腺素,反应的受体称为肾上腺素能受体,(,adrenergic receptor),，分为,和两种类型,(,11/22),;,多种支气管,/,血管扩张药物对,2,受体有激动作用,称之为,2,激动剂,(agonist),如克伦特罗、可乐定,肾上腺素和多巴胺类,为肾上腺髓质分泌、交感神经末梢释放的神经递质，统称为儿茶酚胺；目前人工合成数目繁多的此类药物如多巴胺、麻黄素、苯丙胺及其衍生物，,它们的药物活性与中枢,/,交感神经释放的递质相同，故称之为拟交感神经药剂，也称为神经,递质,(sympathomimetics/,neurotransmitter),药物临床和动物饲养证明：,拟交感神经剂与,2,受体激动剂,(,强心药物莱克多巴胺,),对肾上腺素能,/,受体均有直接,/,间接作用，都具有扩张支气管的作用以及一定剂量时的减少脂肪沉积,莱克多巴胺是美国,FDA,在,2000,年批准使用的动物饲料添加剂，国内禁用，,dopa,adrenalin,noradrenalin,口服无活性；苯丙胺和麻黄素为口服药物，一定剂量以上二者均可抑制食欲及阻止脂肪淀积；添加的可能性极小，但类似结构活性成分可能由植物混入或添加；,2,激动剂和拟交感神经剂的副作用均为交感神经过度刺激的症状：心率加快、肌肉震颤、视力模糊，严重者突发性心脏死亡；,由于共同的应激分泌特点以及物理,/,化学性质的相同，多巴类药物的体外合成药物在,动物组织和体液中,无法检测，但可在饲料中进行检测,拟交感神经剂,/,2,激动剂,分子结构和理化特性,拟交感神经剂一般享有共同的母体结构及苯丙胺,/,羟基取代的苯丙胺结构,理化性质：极性强,(,dopa,：,logP=-1.0,，,M.P 248C,),、伴有一定的热解,/,适于,GC,分析,，羟基的多少造成理化性质的差别；适合碱性液中以,TBME,提取；有一定强度的,UV,吸收,(,280nm),；,除多巴胺外的多数化合物在质谱数据库记载中没有,M,+.,仅有碎片；体液分析中多测定其代谢物,常见,2,激动剂结构具有相同的母体结构，但有一定差异，,LogP,差异虽大，但采,用缓冲液控制,pH,可以,MBTE,提取得到,足够的回收；基本都有一定的,UV,吸收；此类化合物沸点较,高，,Nist,库中记载的未衍生化质谱图基本没有,M,+.,，,一般需,要衍生化,(MSTFA/NaBEt4),后,GC/MSD,分析，现在一般,倾向于采用,LC/MS,分析,dopa,甾体,/,非甾体蛋白同化激素,甾体蛋白同化激素,(Anabolic Steroids),-,俗称合成类固醇，是合成代谢类药物，促进蛋白质合成，减少氨基酸分解，促进肌肉增生，,提高动作力度,，增强男性性征；,促进血细胞生成,-,非医疗目的而使用,(,滥用,),此类药物,则会导致：,生理后果,:,引起人体内分泌系统紊乱、肝脏功能损伤、心血管系统疾病、肿瘤,/,恶性肿瘤、免疫功能障碍；,心理问题,:,抑郁情绪、冲动、攻击性行为；强烈的心理依赖,非甾体类蛋白同化激素,(non-steroids anabolic agent)-S,elective Androgen Receptor Modulators(SARMs),-,以喹啉酮衍生物,(quinolinone),为代表,部分衍生物为雄激素受体激动剂,，与雄激素生物活性类似；部分为受体拮抗剂可干扰雄激素的作用；目前临床前研究多着眼于前列腺肿瘤的治疗，即拮抗剂的研究；,兴奋剂研究集中在激动剂的研究,；有大量文献报道；,结果符合传统判断标准：即,瘦体重,/,骨骼肌增加,MW256,甾体,/,非甾体蛋白同化激素,基因兴奋剂：,PPAR-,Agonist(,GW1516),(peroxisome,proliferators-activated delta receptors,过氧化物酶体增殖物激活,受体,),激动剂,-PPAR,分为、,(),、三类，前二者分布在各不同组织，功能涉及糖代谢、脂代谢及人体免疫系统；,PPAR-,存在于细胞核中，调节与细胞代谢和能量循环有关,的酶；,GW1516,离体,培养可见肌细胞葡萄糖吸收增强，,骨骼肌,蛋白合成加速,；,GW1516,于,2008,年作为,被,禁用,-PPAR-,激动剂是注册临床药物，,PPAR-/,尚处临床实验阶,段；前两个在降压、降脂中药,/,保健品中已经屡次发现；,PPAR-,仍处在临床前研究，是否在国内竞技体育中使用？,PPAR,、激动剂典型药物结构,PPAR-,激动剂：罗格列酮,Rosiglitazone,；胰岛素增敏剂,PPAR-,/,双重激动剂：莫格他唑,Muraglitazar,控制血糖,/,血脂,PPAR,激动剂,:GW1516,、,GW0742(1516+1F,原子,),C18H19N3O3S=357 C29H28N2O7=516.5 C21H18F3NO3S2=453,Rosiglitazone Muraglitazar,*,GW1516,*,2005,年施贵宝,/,默克宣布,III,期临床试验完成，,2009,年宣布由于无法按,FDA,要,求证实该药心血管安全性，准备放弃研制,雄、雌、孕、糖皮质激素结构特点,Testosterone MW 288 DHT MW290 estradiol MW 272 estrone MW 270,Cortisone MW 360 cortisol MW362 dex MW 392 betametha.MW 392,androsterone,MW 290,androstandiol,MW 292,pregnenolone,MW 316 progesterone,MW 314,甾体结构化合物特性,甾体化合物包括：雄、雌、孕激素,、糖皮质激素，基本碳数结构分,别为,19C,、,18C,、,21C,、,21C(21C,的多为外源性化合物,),；在未知物,鉴定中相同分子量的甾体未知物的碳数可以帮助区分甾体类别,化学结构稳定、基本不溶于水、均溶于甲醇等、沸点高、极性中等、,紫外吸收系数较小，但具有一定的特征,上述几类激素为人类和某些动物内源性物质，并有成熟的人工合成,路线,;,其合成产物在结构和质谱特征上与人体自身分泌的没有任何区,别仅,12,C/,13,C,的同位素比值有微小区别,(IRMS,质谱测定的依据,),人体内源性甾体激素的分泌、转运、代谢、消除,有大量成熟的研究,结果,而动物的则很少，但人体研究对动物的有重要参考价值,甾体化合物有多种代谢方式，产物很多，常见的有羟基化、表化、,还原、缀合,(,甙,II,相代谢,),等，对尿液、粪便、胆汁样品分析，多以代,谢物为目标,T-UV,甾体激素,CID,质谱特征,以睾酮为代表的,雄性激素,及其代谢物、,糖皮质激素,在,CID,质谱中均有脱水的强烈倾向，产生,M+1-18,的碎片离子，脱水可能是一个,H,2,O,也可能是,2,个甚至,3,个（,ESI+,）；,M+1-H2(,雄酮,/,雄烷二醇,),含氟的糖皮质激素可产生,M+1-20,碎片离子，,-HF,泼尼松类除脱水峰外尚有,M-1-30(1,分子甲醛，,ESI-,),为其特征,饱和结构的甾体如雄烷二醇离子化困难，,ESI,灵敏度均较低且基本上没有,M+1,峰，可采用,APCI,接口提高离子化程度,甾体质谱也会产生小质量碎片离子，如,THG,的,m/z,159,trenbolone,的,199,等，但其开裂方式不能很好解释且基质干扰多，在以标品对照确认后可以作为,MRM,目标离子；,甾体雄性激素检测方法,样品前处理及检测方法：,-,尿液及动物肝脏中内源性甾体激素少部分以游离形式，大部分以缀合,物,(conjugation),形式出现；结合形式：葡萄糖醛酸甙,/,芳香硫酸酯；,葡萄糖醛酸酶,(Glucuronidase/arylsulfatase from Helix Pomatia/E.coli,),在生,理条件下可以将缀合物水解为游离形式；,动物肝、肾、肺需要酶解,；,-,叔丁基甲醚提取,/,衍生化,/GC-MSD,分离检测；也可用,SPE,提取,/,纯化,-,外源性甾体激素经酶解,/,提取,/,衍生化,/GC-MSD,；部分热不稳定物,/,衍生,化困难者以,LC/MS/MS,检测,(,见后,),-LC/MS/MS,方法：前处理方法同,不衍生化,/,甲醇再溶解；,C18,柱,(3.5umx150mmx2.1mm)/,甲酸铵,/,乙腈,/ESI+/MRM,采集,/,数据定性分,析模板,+,自动打印；该程序,(,前处理,+,仪器方法,),可以检测部分甾体雄激素,、糖皮质激素、热不稳定刺激剂,(mesocarb,ritalin etc),、芳香酶抑制剂、,抗雌激素、,SERMs,由于甾体尤其是饱和甾体结构离子化困难，灵敏度低，内源性甾体许多,情况下仍需采用,GC/MSD,含共轭双键的,蛋白同化激素检测,Trenbolone/270 gestrinone/308,THG/312 methyltrienolone/284,共轭结构导致衍生化困难,，,GC/MS,分析没有实用方法,有较强的,UV,吸收,=28000,，,一段时间内采用,HPLC/DAD,但仅凭,UV,谱,无法确证；,LC/MS/MS(ESI+),可以在,ppb,级水平检测出母体,/,表化,/,羟基化产物，液,相对,-/,-,异构体,分离有较好效果，因此表化,代谢物可以分离,奶粉中激素的检测,奶粉中孕酮,/,雌二醇：“,在送检的,42,份圣元优博乳粉中，未检出外源性的已烯雌酚和醋酸甲孕酮，,仅检出低含量的,内源性,雌激素和孕激素,；,检出的雌激素总量为,0.2-2.3g/kg,，孕激素总量为,13-72g/kg,。其中患儿家中存留样品中检出的雌激素和孕激素分别为,0.5g/kg,和,33g/kg,。以上检测结果符合国内外文献报道的含量范围；,婴儿奶粉中要做的工作：,1.,上述,内源性,结论的依据是,建立在一般性的泌奶机制上的，在人工授精和维持妊,娠的过程中所使用的药物是否确定不造成外源性激素,的侵入？,2.,黄体酮作为雄性激素的前体其蛋白同化作,用是确认的，,1370ppb,是否为安全水平？,3.,以同位素质谱确认奶粉中的孕激素内源性属性,GC/C/IRMS,用于区分内外源性甾体化合物,12,C/,13,C,平均天然同位素丰度：,1,：,0.01,1,不同植物种属的,12,C/,13,C,有微小的差异，,0.00,x,差异,值乘,1000,作为单位，即,%,0,人体绝大部分内源性甾体的,12,C/,13,C,有别于以植物为原料人工合成,的外源性甾体化合物，目前已经得到实验证明，成为同位素质谱,区分人体尿液中内,/,外源性甾体化合物的依据；其他药物的,12,C/,13,C,区别上有待证明；,动物体内的内源性甾体与外源性甾体化合物是否有,12,C/,13,C,的丰度,区别有待证明；目前推断区别的存在基于前期的相关研究,由于内,/,外源性合成类固醇在动物体内的代谢享有同样的方式和通,道，测定中要寻找,/,筛选对外源性合成类固醇为“惰性”的化合物,（代谢物）为参照物，这需要大量的以,GC/MS,为方法的筛选工作,Identifier 1,Start,Rt,End,d 13C/12C,Ampl 44,Area 44,Area 45,Area 46,40ng,712.5,717.1,726.9,-34.158,304,1.498,0.017,0.006,40ng,711.9,717.1,734,-34.084,723,3.306,0.038,0.014,40ng,711.6,716.9,733.8,-33.881,704,3.329,0.038,0.014,40ng,712.1,717.1,734,-33.604,719,3.338,0.038,0.014,40ng,712.9,718.5,734.8,-33.225,1020,4.657,0.053,0.019,40ng,711.4,717.1,736.9,-32.936,1158,4.991,0.057,0.02,40ng,711.6,717.3,734,-32.784,1056,4.742,0.054,0.019,40ng,711.2,716.9,736.7,-32.783,1158,5.006,0.057,0.02,40ng,711.6,717.3,737.1,-32.709,1154,5.113,0.059,0.021,40ng,711.4,717.3,734,-32.706,1031,4.674,0.054,0.019,40ng,711.4,717.1,736.3,-32.672,1107,4.869,0.056,0.02,40ng,711.6,717.5,734.6,-32.647,1085,4.921,0.056,0.02,40ng,711.2,717.1,736.7,-32.476,1141,5.025,0.058,0.021,40ng,711.2,717.1,734.4,-32.472,1075,4.921,0.056,0.02,80ng,711.6,717.7,738,-33.507,1350,5.917,0.068,0.024,80ng,711.4,717.7,737.8,-33.072,1506,6.5,0.074,0.027,80ng,711.9,718.3,738.6,-32.792,1713,7.432,0.085,0.03,80ng,711.4,718.1,738.4,-32.626,1807,7.95,0.091,0.032,平均值：,-32.918,STDEV:0.539,未衍生化外源性孕酮的,%,0,测定值：,几类激素药物前处理与仪器方法,Beta2,激动剂,/,拟交感神经剂：提取以及酸性溶液,+,少量有机溶剂；拟交感神经剂,SPE,纯化，,beta2,激动剂可以,LLE/SPE,萃取纯化,酸水溶液,+,有机溶剂提,取后的糖、孕、雄、雌激素可以,C18-,硅胶粉、高聚物填料或混合填料为纯化材料；动物组织以,SPE,为宜，动物体液可用,LLE,或,SPE;,酶解与,SPE,的先后可视具体样品而定,拟交感神经剂,LC,柱上保留很短，以,GC/MS,分析较好；,beta2,激动剂则可以,LC/MS,分析或,GC/MS,分析；体液分析适合拟交感神经剂的代谢物测定，如肾上腺素代谢物香草扁桃酸,(VMA),GC/MS,分析衍生化以,MSTFA+NH4I(TMIS),为试剂,适合合成类固醇和,beta2,激动剂,;,拟交感神经剂无需衍生化,糖皮质激素使用,LC/MS,方法，可以皮质酮,/,皮质醇为内标；人体,24h,尿液,:,皮质酮,/2-10ug,皮质醇,/10-100ug;,马尿中：皮质醇,/50-100 nmo/L(20ng/ml),尽可能采用多组分同时测定,(,高通量,),，尽可能地减少工作量并实施更好的质控,多组分同时分析和窗口式筛选分析报告,(,d,iuretics,/200ng/ml;,stimulant,500ng/ml;,-blocker,500ng/ml;,Spiked,）,人体尿液糖皮质激素、雄激素及其他化合物筛查,谢谢！,