实用HPLC方法的建立_华东理工大学分析测试中心_87页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实用,HPLC,方法的建立,华东理工大学分析测试中心,目录,1 前言,2,HPLC,方法建立的步骤,2.1 了解样品的有关情况,2.2 明确分析目的,2.3 样品的预处理与检测,2.4,HPLC,分析模式的选择,2.5 色谱条件,2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理,2.7 定性和定量方法的建立及论证,3 色谱条件的选择,3.1 流动相的选择,3.2 检测器的选择,3.3 样品的溶解及预处理,3.4 样品的进样量,3.5色谱柱的选择及保护与再生,3.6 泵的选择,3.7 色谱工作站,4 分析方法建立的实例,4.1 等度分析,4.2 梯度方法的建立,4.3 色谱柱及,pH,的影响,5 色谱分析中各种图谱现象的判断,5.1 基线噪音的产生和处理,5.2 基线漂移(上漂和下漂),5.3 倒峰的产生和消除,5.4 鬼峰的产生和消除,5.5 峰前移和退后的判断,5.6 前沿峰和拖尾峰的判断,5.7色谱双峰的判断,5.8 色谱峰变胖的判断和处理,1 前言,HPLC,作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。,HPLC,技术的发展和科技的进步，使得,HPLC,广泛应用到各个领域。,HPLC,实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。,HPLC,技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。,出的来，跑的快，分的开,2,HPLC,方法建立的步骤,2.1 了解样品的有关情况,首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的（同一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。,样品的重要性质包括：,所含化合物的数目；,化学结构（官能团）；,分子量；,pKa,值；,UV,光谱图；,被测组分在样品中的浓度范围；,样品的溶解度、沸点及其稳定性；,可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。,1,分析大分子、小分子还是生物分子,一般常规的,HPLC,分析分子量2000以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。,2,样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。,如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。,3,测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。,主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。,4,分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。,非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。,弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的,pH。,离子化合物可以采用反相，调节,pH；,或者添加离子对试剂；也可采用离子交换。,两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。,对于极性的糖类物质，可用,NH2,柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。,大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。,手性化合物，则要用手性流动性或者采用手性柱。,5,样品的溶解度、沸点,样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型,。,非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。,极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同,pH,下区别可能很大。,极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度。,从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。,易挥发性的低沸点的物质在,ELSD,中难以检测。,有存在特例。,6,样品的稳定性,如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。,对光敏感物质，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，随配随做。,易水解的物质、要选择合适的溶解溶剂。,有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。,易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节,pH，,如,PAP,的测定。胺类化合物。,产品不稳定的化合物，分析越快越好。,7,化合物的化学结构（官能团）,常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有,COOH、OH、NH2、SO3H、Cl（Br）、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-,等。,亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。,从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。,8,化合物的,pK,值,知道,pK,值，有助于方法的建立，尤其流动相,pH,的选择。,pK,的差异是官能团造成的。,9 UV,光谱图,知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有,DAD,则关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。,同一样品在不同的流动相及,pH,最大波长可能不一致。,有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收,10,样品的复杂层度,梯度方法分析,预处理,分成几个部分分析,痕量物质的富集,总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。,2.2 明确分析目的,1 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？,2 是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？,3 定量分析的准确度和精密度？（主成分在12）,4 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）,5 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。,6 实验室的条件，如,HPLC,仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室人员的操作技能；方法的移植等等。,2.3 样品的预处理与检测,样品来源的形式,1 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）,2 需稀释、,pH,缓冲、加内标或其它操作,3 固体样品选择合适的溶剂,4 需提取分离的样品,5 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。,总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率。,2.4,HPLC,分析模式,按照样品的特性分为以下二类：,A,一般样品（强有机溶剂)通常最有效。,低,pH,流动相,如 0.1%,TFA or 0.01M H3PO4,也是有效的。,升高温度（60-80）,色谱柱的修复和再生-化学变化,II,Example:,4.6 mm ID x 15 cm,Zorbax,300SB-C18,Flow rate:1,mL,/min;Temp:80,A:0.1%TFA in water,B:0.1%TFA in,acetonitrile,100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;,Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 min.,Repeat 3 times。,6,M,盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积。,XDB,有机聚合物等填料可使用高,pH,水溶液/有机溶液，如：,0.01,M,NaOH,50%,异丙醇/水溶液，硅胶基质应尽量减少接触时间(15-30,min)。,3.56 色谱柱使用的几个注意点使用保护柱,样品和流动相过滤,柱子反做(当正做实在不行时),当柱压明显升高时，对柱头塞板清洗及更换部分填料。,少使用离子对试剂,色谱柱避免强酸强碱接触，选择合适保存条件。,分析时，避免长时间色谱柱进大量气泡，长时间不用，经常保存流动相过，防止柱子干掉。,3.6 泵的选择,泵可分为单泵、双泵和四元泵。方法建立建议用双泵或四元泵。,泵也可分为高压混合和低压混合。四元泵是低压混合。,高压混合不易出气泡，低压混合应严格脱气，最好用在线脱气机。,为避免气泡产生，可在柱后接反压柱。,分析完后，避免盐类在管路中过夜。,泵的运行压力建议不超过极限值的5060。,3.7 色谱工作站,如有可能，建议采用原装色谱工作站。有的单位因经费紧张，采用国产工作站，这也可以的。,国内工作站种类很多，但技术支持都比较弱。,研究、方法开发的单位还是采用原装工作站比较好，并注意及时升级。,4 分析方法建立的实例,4.1 等度分析,色谱柱：,C18，4mm30mm,流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱,流速：2,ml/min,样品：,对羟基苯甲酸甲酯(,Methyl,Paraben,),对羟基苯甲酸丙酯(,Propyl,Paraben,),对羟基苯甲酸丁酯(,Butyl,Paraben,),改变容量因子,K,改变选择性,a,通过改变流动相改变选择性,同样强度的不同溶剂,改变色谱柱,4.2 梯度方法的建立,梯度洗脱的特点,优点,单位时间的分离能力增加,检测灵敏度提高,缺点,仪器设备要求高,不适合某些检测方式,柱需再生,定量分析的重复性较低,分析时间长,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度洗脱的可变参数,A,及,B(,可能还有,C,和,D,液)的成分和化学特性,梯度的陡度,梯度的变化形状,如不用梯度：分离不理想,梯度条件的优化,梯度曲线的变化凹线,梯度曲线的变化凸线,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟,平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。,有机污染物的影响（一）,50,ml,超纯水的有机物污染状态,有机污染物的影响（二）,“,三蒸水,”,有大量的有机污染物不适合梯度分析,有机污染物的影响（三）,典型的,“,实验室水,”,有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析,梯度方法开发实例-第一步,开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用,C18,柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好,梯度方法开发实例-第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。,梯度方法开发实例-第三步,从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。,梯度方法开发实例-第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。,梯度方法开发实例-第五步,根据,“,梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强,”,的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%,B)，,但是小峰仍没有分出来。,梯度方法开发实例-第六步,根据,“,梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强,”,的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%,B,见到好的现象。,梯度方法开发实例-第七步,最后用50-90%,B，,曲线4，得到好的结果。,4.3 色谱柱及,pH,的影响,尿,嘧啶,3-,丁基,吡啶,4-,苯基,丁胺,4,-,苯基丁酸,苯酚,丙,基苯,1,4-,二羟基蒽醌,N,N-,二,乙基间甲苯酰胺,丁基,苯,*4-,Phenylbutylamine,was not used for testing at pH 2.5,*4-,Phenylbutyric,acid was not used for testing at pH 7,苯,基,a,芘,1,2:3,4:5,6:7,8,-,四,苯基萘,菲,3,4-c,并,菲,HPLC,条件,-,试验,1,流动相,：,乙腈：,20mM,磷酸钾,缓冲液,pH 2.5(65:35),流速,:,1.0mL/min,柱温,:,30,C,紫外检测器,:,254nm,进样量,:,10,L,样品,(mg/mL,):,尿,嘧啶,(0.025),3-,丁基,吡啶,(0.067),苯酚,(0.90),4-,苯基,丁酸,(2.1),N,N-,二,乙基间甲苯酰胺,(0.66),1,4,二羟基蒽醌,(0.20),丙基,苯,(5.0),丁基,苯,(6.7),用,流动相溶解,HPLC,条件,-,试验,2,流动相,:,乙腈,:20mM,磷酸,盐缓冲液,pH 7.0(65:35),流速,:,1.0mL/min,柱温,:,30,C,紫外,检测器,:,254nm,进样,体积,:,10,L,样品,(mg/,mL,):,尿,嘧啶,(0.05),3-,丁基,吡啶,(0.02),苯酚,(1.0),4-,苯基,丁胺,(4.0),N,N-,二,乙基间甲苯酰胺,(1.0),1,4-,二羟基蒽醌,(0.20),丙基,苯,(4.0),丁,基苯,(4.0),用,流动相溶解,流动相,:,乙腈:H2O,(85:15),流动相,:,2.0mL/min,柱温,:,25,C,紫外,检测器,:,254nm,进样,体积,:,10,L,样品,:,苯,a,芘,1,2:3,4:5,6:7,8-,四,苯基萘,菲,3,4-c,并,菲,丙酮,HPLC,条件,试验,3,Column:,Alltima,C18,5,m,150 x 4.6mm,1,a,碱,灭活,1,b,非,碱灭活,1.,尿,嘧啶,2.,3-,丁基,吡啶,3.,苯酚,4.,4-,苯基,丁酸,5.,N,N-,二,乙基间甲苯酰胺,(DEET),6.,1,4,二羟基蒽醌,7.,丙基,苯,8.,丁基,苯,Column:,Adsorbosphere,C18,5,m,150 x 4.6mm,pH 2.5,的色谱图,2,a,碱,灭活,2,b,非,碱灭活,pH 7,的色谱图,Column:,Alltima,C18,5,m,150 x 4.6mm,Column:,Adsorbosphere,C18,5,m,150 x 4.6mm,1.,尿,嘧啶,2.,苯酚,3.,4-,苯基,丁胺,4.,N,N-,二,乙基间甲苯酰胺,5.,3-,丁基,吡啶,6.,1,4,二羟基蒽醌,7.,丙基,苯,8.,丁基,苯,pH2.5,pH7.0,1.,丙酮,2.,苯,a,芘,3.,菲,3,4-c,并,菲,4.,1,2:3,4:5,6:7,8-,四,苯基萘,3,a,Platinum,C18,5,m,150 x 4.6mm,3,b,Nucleosil,C18 AB,5,m,150 x 4.6mm,3,c,Inertsil,ODS-2,5m,150 x 4.5mm,5 色谱分析中各种图谱现象的判断5.,1 基线噪音的产生和处理,可能产生的原因及处理办法,1 流动池脏，用极性试剂清洗。当有填料进入，拆开流通池。,2 检测器灯有问题，如能量偏低，更换氘灯。,3 周期性的波动，则起源于泵的脉冲，检修泵或更换垫片等。,4 温度对检测器的影响，控制温度。,5 气泡经过检测器，用大流量冲洗。,6 可能难出峰的样品连续不断出来，用强极性流动相冲柱。,7 流动相本底高，如水的纯度不够，换超纯水。或试剂纯度不够，换色谱纯的试剂。,8 注意数据采样和连接问题。,Time(min.),5.2 基线漂移（上漂和下漂）,1 柱中的流动相没有平衡，延长平衡时间，尤其在流动相中添加了有紫外吸收的添加剂。,2 在梯度洗脱中，基线上漂是正常的，在空白梯度中有可能是柱子中有杂质洗出。其次是流动相中有干扰物。换流动相。,3 温度不稳定（示差检测器），控温。,4 在等度分析中，样品缓慢洗出，改变淋洗液强度或用梯度分析。,5 样品进入检测器，吸附在池中，可能每进样一次，本底一次比一次高，很少见。,5.3 倒峰的产生和消除,1 柱切换的脉冲效应，一般不是很明显，必要时考虑换阀。,2 在低波长分析时，流动相本底比较高时，而样品用本底低的流动相溶解，肯定出现倒峰，其程度同进样量和本底差有关。解决办法，用流动相溶解样品，减少进样量，消除倒峰的影响。高波长时,影响比较小。,3 如果倒峰不影响峰的分离，对外标法定量不影响。但影响面积归一化法。,4 样品中有比流动相本底低的物质存在，如无机盐等，将出倒峰。这种情况下，倒峰的位置不一定在死体积位置出现（大多数在死体积位置出现）。,5.4 鬼峰的产生和消除,1 样品分析时峰没出完，在下一针或下下一针出现，判断办法，延长分析时间，计算可能出现的保留时间。然后调整流动相。,2 连续进样，在某个位置出现忽高忽低的峰，最可能是进样针污染，清洗进样针，注意黑垢的干扰，有些样品易残留在针管里。可重新取样分析。,3 定量管污染，处理方法同上。,4 在死体积位置出现的小峰，可能是柱切换造成的。,5 流动相与样品溶剂不一致，也会出现鬼峰，尤其在低波长时，出现位置在死体积的地方。,6 气泡，如果有小气泡通过流通池，也出现随机的假峰，大气泡存在，其出现的峰往往直上直下，脱气解决。,7 样品发生变化反应，重新取样快速分析。,5.5 峰前移或退后的判断,1,有规律的变化一般可能是流动相没平衡，如低浓度的缓冲液或离子对试剂，样品对,pH,变化极敏感。,2 温度变化，当天气变化快，分析时间长，比较明显，用柱温箱，空调解决此类问题。,3 流动相挥发，尤其用挥发性的酸时，时间长了酸度会发生变化，流动相新鲜配置。,4 仪器尤其泵的运行时间长后，重现性不好，仪器老化，在梯度分析时尤其明显，也可能流速不稳，或有气泡。,5 在分析某样品后，柱子可能发生改性，再次分析重现性变差，清洗或再生柱子。,6 进样浓度不一，溶剂不一，也会造成保留时间不一致。,5.6 前沿峰和拖尾峰的判断和处理,5.6.1 前沿峰的产生和处理（对称性小于0.9),1,色谱柱漏穿，柱效明显偏低，柱压偏低，如所有峰都出现，换柱。,2 样品溶剂极性远大于流动相，局部改变了流动相平衡体系，办法是减少进样量，更换样品溶剂。,3 分离不完全，有大量峰重叠，（如系列物），办法，改变流动相，采用梯度洗脱。,5.6.2 拖尾峰的判断和处理（对称性大于1.2）,1 色谱柱柱头塌陷，有死体积，柱效明显下降，所有峰都如此，换柱。,2 色谱柱填料流失，例如,C18,在碱性流动相中，一般是使用较长时间后造成的，换柱。,3 用,C18,柱分析碱性化合物，可用,BDS,柱或未端封尾柱，或在流动相中添加减尾剂（三乙胺等）。,4 过载或超载，有可能在检测器上由于灵敏度差，响应小，办法，减少样品浓度和进样量。,5 保留性太强，出峰太迟，办法，增加洗脱强度。,6 管路有死体积，或连接管路太长，或在管路中有保留。,7 分析体系不合理，如苯基多磺酸类的化合物在酸性的有机相中分离，会出现正三角形的峰，解决办法，用离子对试剂，改变,pH。,8,在分离过程中，可能发生结构变化，或存在结构互变，办法，用其它分析体系。,9 分离不完全，后面带有小峰，采用梯度或改变流动相。,10 样品溶解体系同流动相不匹配，样品在柱子中析出。,5.7 色谱双峰的判断,1 柱头或筛板杜塞，污染，处理办法，清洗筛板或对柱头填料修补。问题是柱效会下降。,2 溶剂极性太强或在二相中差异太大，换溶剂，或减少进样量。,3 过载，减少进样量，或进样体积。,4 采样频率过快，降低采样频率。,5 样品的溶解度，样品难溶于流动相时，会出现。,6 存在互变异构现象，双峰基本齐平。,7 样品存在动态反应，如酸与盐（间苯甲酸与间苯甲酸钠），在特定,pH,条件下会出双峰。,8 确实是二个组分混合在一起，改变流动相体系。,5.8 色谱峰变胖的判断和处理,1 死体积增加，如管路和连接管，可能用粗的代替细的，解决办法，缩短连接管路，用细管。,2,柱效降低，色谱柱受损，换柱。,3 流动相不合理，单一如只用甲醇水体系，没有添加改性剂，,pH,调节剂，也可能柱子选择有问题。一般除了非极性化合物外，流动相中建议都加盐等化合物，可以提高化合物的分离柱效。,4 溶解与分离体系不一致，如用乙醇溶解样品在甲醇体系中进样，会造成峰位移和峰变宽。,5 大体积进样，在分析柱中进样超过100,ul,。,6,柱和仪器匹配不合理，如2.1,mm,内径的色谱柱（包括一体化的柱子，检测器的死体积问题），其管路要求比较细，4.6,mm,做的好的，2.1的就不行。,本人联系地址：,华东理工大学分析测试中心 200237 施超欧,E-,Mail：,shichaoou,hplc,OICQ:40005964,电话：[phone]，2832,