液相色谱质谱联用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,液相色谱质谱联用（,LC-MS-MS),在食品检测中的应用张 辉,水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的检测,背景,性质：孔雀石绿,(MG,又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿,),是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料,;,常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂毒性作用：,MG,代谢物具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，并能在鱼体内长时间残留。,加拿大在,1992,年发现人类若进食含孔雀石绿的鱼类，会对健康构成重大影响，主要是孔雀石绿中的三苯甲烷基团所致。,各国的管理要求,Codex,：无规定,国际食品动物养殖业禁用药物,美国、欧盟、加拿大、日本、英国、泰國、新加坡等许多国家已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。,欧盟（,2004/25/EC,）,以,2,g,/kg,（,MG,LMG,总量）为执行限（,MRPL,），对象：水产品及其制品；,中国：,于,2002,年,5,月将,MG,列入,食品动物禁用的兽药及其化合物清单,中，禁用于所有食品动物。农业部第,235,号公告规定孔雀石绿的限量值,(,执行限）为,0.5g/kg,（,GB/T 20361-2006 MG,总量的,LOD,为,0.5g/kg,）,来自,农业部,2007,年城市水产品质量安全例行监测方案,。,MG,及其类似物,CV,孔雀石绿：,(MG,：孔雀石绿(MG,又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿)是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料,),分子式：,C,23,H,25,C,l,N,2,，分子量：,364.92,。,隐形孔雀石绿（,LMG,）：分子式,C,23,H,26,N,2,，分子量：,330,。具有光泽的结晶粉末，不易挥发，极易溶于水，水溶液呈兰绿色,(4.0g/100ml),。能溶于乙醇、甲醇或戌醇。,结晶紫（,Crystal Violet,，,CV,）：分子式：,C,25,H,30,N,3,Cl,，分子量,407.98,，熔点,175-180,。,隐色结晶紫（,Leuco,Crystal Violet,，,LCV,）：,分子式：,C,25,H,31,N,3,，分子量,373.54,，白色结晶粉末，熔点,177,。,孔雀石绿及其类似物,LC/MS/MS,的质谱确证法,液相色谱条件：,色谱柱,:,安捷伦,ZORBAX Eclipse plus C18,柱（,2.1,100mm,3.5-micron,）,流动相：乙腈,-5mmol/L,乙酸铵梯度洗脱,流速,:0.4ml/min,。,柱温：,40,进样量：,10L,Time(%),乙酸铵,(%),乙腈,(%),0.00,25,75,4.00,5,95,5.00,25,75,9.0,25,75,质谱条件,离子化模式：电喷雾电离正离子模式,ESI+,干燥气温度,350,、,干燥气流速,11L/min,；,雾化器压力：,35psi,毛细管电压：,4000V,质谱扫描方式：多反应离子检测模式,质谱扫描方式：多反应离子检测模式（,MRM),标准溶液的配制,a),标准储备液,：孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫各,0.0100g,分别用甲醇溶解并定容至,10mL,，浓度为,1mg/mL,，,-18,冰箱,保存,有效期,12,个月,b),内标物：,D6-,孔雀石绿（,100ug/ml,）、,D6-,无色孔雀石绿（,100ug/ml,）,c),基质加标标准工作曲线的制备：,将标准储备液混合用,初始流动相,逐级稀释,成,0.1g/L,10.0g/L,流动相的配制,:,5mmol/L,乙酸铵,:,称取,0.385g,乙酸铵，加水至,1000mL,，加乙酸,5,滴，精密,pH,试纸在,4.5,左右。,乙腈（色谱纯）,c,）,初始流动相配比：乙腈,+5mmol/L,乙酸铵,=75+25,操 作 步 骤（提取、净化）,均质样品称取,5.0g,加入,50.0L,内标（,200ng/ml,）,加入,25mL,乙腈，混匀，超声,15min,离心,10000r/min,，,10min,5 ml,乙腈活化中性氧化铝固相萃取柱,（活化）,5mL,经离心后的样品上清液，上样,，,并收集流出液,再加,4 ml,乙腈,淋洗小柱并,收集流出液（收集滤液共,9.0mL,）,流出液用,50,以下氮气吹干,用初始流动相溶解并定容至,1.0ml,（过,0.22m,滤膜上机测定）,注：内标总质量,10ng,，取,25mL,提取液中的,5.0mL,净化、浓缩至,1.0mL,后上机测定，相当于该溶液浓度为,2.0ng/g,样品，与标准系列完全一致。,分析结果,孔雀石绿,结晶紫,无色孔雀石绿,无色结晶紫,孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫,TIC,色谱图,孔雀石绿,MRM,色谱图,无色孔雀石绿,MRM,色谱图,无色结晶紫,MRM,色谱图,结晶紫,MRM,色谱图,加标鱼样品提取物的,MRM,色谱图,1.0ng/g,孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫,标准系列,0.2-2.0ng/g,动物源性食品中,-,受体激动剂残留检测方法,液相色谱质谱,/,质谱法,（安捷伦,6430,）,-,受体激动剂结构、分类,-,兴奋剂：一类人工合成的苯乙胺类药物,结构：,分类：苯酚型及苯胺型,性质：溶于多数极性或中等极性溶剂,方法原理、适用范围,a),方法原理,试样中,-,受体激动剂残留经酶解后超声提取，低温离心后，上清液用安捷伦,P,CX,固相萃取柱净化，液相色谱,-,质谱,/,质谱测定，基质加标外标峰面积法定量。,b),适用范围,猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、福莫特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺,A7,种,-,受体激动剂类残留量的高效液相色谱质谱,/,质谱测定,质谱条件,离子化模式：电喷雾电离正离子模式,ESI+,干燥气温度,350,、,干燥气流速,10L/min,；,雾化器压力：,35psi,毛细管电压：,2500V,质谱扫描方式：多反应离子检测模式,色谱条件,色谱柱,:,安捷伦,ZORBAX Eclipse plus C18,柱,2.1100mm 3.5-micron,）,流动相：甲醇,-0.1%,甲酸水梯度洗脱,流速,:0.3ml/min,。,柱温：,40,进样量：,10L,Time(%),0.1%,甲酸水,(%),甲醇,(%),0.00,5,95,4.00,50,50,11.00,90,10,11.50,95,5,12.0,5,95,17.0,5,95,质谱参数,样品提取过程,试剂：,pH5.2,乙酸,乙酸钠缓冲液,:,称取,3.0gNaAc3H2O,乙酸钠和约,2.5mL,冰乙酸，加水溶解并定容到,1000mL,水中。,称取,5.0g,（精确到,0.01g,）样品，于,50mL,离心管中，分别加入,500L 0.01mg/L,内标液，混匀，静置,10min,，加入,10mL pH5.2,乙酸钠,-,乙酸缓冲溶液，混匀，加入,100L-,葡萄糖醛苷酶，,37,酶解,16,小时后取出冷却，超声振荡,15min,。,410000r/min,离心,10min,。倾出上清液，收集。残渣再用,10mL pH5.2,乙酸钠,-,乙酸缓冲溶液提取一次，,410000r/min,离心,10min,合并上清液。再离心，合并上清液过,PCX,固相萃取柱。,净化流程图,固相萃取净化,PCX,小柱,活化,1,）,6 ml,甲醇,2,）,6 ml,水,上 样,淋洗,1,）,6 ml,水,2,）,6 ml,甲醇,3,）,3 ml 0.1%,甲醇氨溶液,洗脱,6ml 2%,甲醇氨溶液（收集）,收集，,45,氮气吹干,1 ml,甲醇：,0.1%,甲酸水溶液（,5,：,95,）定容,LC/MS/MS,检测,定容液的选择,结果分析（,0.5-5.0ppb,）,沙丁胺醇,特布它林,菲诺特罗,莱克多巴胺,克伦特罗,妥布特罗,苯乙醇胺,A,基质加标,2.0ppb,线性范围,0.5-5.0ppb,注意事项,酶解的必要性,安捷伦,PCX,淋洗和洗脱条件,保证氨水的纯度！（尽量选择新购试剂）,定容液中甲醇的比例（甲醇控制在,10%,以内）,基质样品的必要性,动物性食品中硝基呋喃及其代谢产物残留量检测,背景,硝基呋喃类药物是人工合成的具有,5-,硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药。对多数革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌具有较强的抗菌作用。主要适用于肠道细菌感染及原虫病。低浓度抑菌高浓度杀菌,几乎不溶于水和乙醇，但遇碱可分解，遇光颜色逐渐变深，应避光密封保存,几年前在畜牧、水产养殖中被广泛应用，后来研究发,现，硝基呋喃类药物及其代谢物在动物源性食品中的,残留可以通过食物链传递给人类。呋喃它酮有强致癌,性，呋喃唑酮有中度致癌性，硝基呋喃类化合物是直,接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细,菌的突变。,硝基呋喃类药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，结合态可长期保持稳定，从而延缓药物在体内的消除速度。这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此，当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。,限量要求,1993,年美国禁止呋喃唑酮作为兽药使用。,2002,年美国全面禁止将硝基呋喃类药物用于食源性动物。,日本,2006,年,5,月实施肯定列表：不得检出,欧盟,96/23/EC,：不得检出，,A,类禁用药物,中国：,2002.5,起禁止使用,方法原理,在酸性条件下使硝基呋喃代谢物从结合态中游离，并在,37,避光条件下与,2-NB,衍生反应。,质谱条件,离子化模式：电喷雾电离正离子模式,ESI+,干燥气温度,350,、,干燥气流速,12L/min,；,雾化器压力：,35psi,毛细管电压：,4000V,质谱扫描方式：多反应离子检测模式,色谱条件,色谱柱,:,安捷伦,ZORBAX Eclipse plus C18,柱（,2.1100mm 3.5-micron,）,流动相：乙腈,-5mmol/L,乙酸铵（,0.1%,甲酸）梯度洗脱,Time(%),5mmol/L,乙酸铵（,0.1%,甲酸）,乙腈,(%),0.00,90,10,8.00,10,90,11.00,10,90,12,90,10,20,90,10,流速,:0.3ml/min,。,柱温：,30,进样量：,20L,质谱扫描方式：多反应离子检测模式（,MRM,）,化合物,母离子,子离子,fragment,CE,AHD,249,104,90,21,134,90,5,AOZ,236,104,90,21,134,90,5,AMOZ,335,262,90,13,291,90,9,SEM,209,166,80,5,192,80,5,AHD-C,13,252,134,90,5,104,90,12,动物性食品中硝基呋喃及其代谢产物残留量的,LC-MS-MS,标准操作程序,试剂：,盐酸溶液：,0.2mol/L,。,量取,17mL,浓盐酸用水定容至,1000mL,。,氢氧化钠溶液：,1,mol/L,。称取,40g,氢氧化钠用水,定容至,1000mL,。,衍生剂：含,2-,硝基苯甲醛,0.05 mol/L,。称取,0.075g,含,2-,硝基苯甲醛溶于,10mL,甲醇，现用现配（不稳定，避光保存）。,酶解过程,均质样品,1.0g,内标,10ng 10ml 0.2M HCL,0.3ml 2-NB,涡旋混匀,37,避光振摇过夜,净化过程,1M,NaOH,调,PH 7.27.5,（约,1.0mL,，不能超过,PH8,）,通过经,3 ml,甲醇、,3 ml,水预先活化的,HLB,固相萃取柱,（离心,10000r/min,，,10min,上清液转入）,淋洗,（,3 ml,水）,洗脱,（,5 ml,甲醇）,洗脱液用氮气吹干,初始流动相定容至,1.0ml,（过,0.22m,滤膜上机测定）,分析结果（,0.5-5.0ppb,）,AMOZ,SEM,AHD,AOZ,线性范围,0.5-5.0ppb,加标,8.0ppb,注意事项,标准储备液一定要冷冻保存，且标准工作液现用现配,衍生剂注意避光保存，现用现配，且衍生夜时应避光操作,调,PH,最好控制在,7.2-7.5,，一定不能超过,8,调,PH,值最好使用精密,PH,试纸，避免交叉污染,谢谢大家,