第五章电泳分析技术.ppt

,*,雨雾,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,雨雾,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,雨雾,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,雨雾,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,雨雾,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,雨雾,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第五章电泳分析技术,目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。,临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。,第一节 电泳原理,第二节 常用电泳技术和电泳方法,第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,第五节 电泳仪的临床应用,第六节,电泳技术的质量控制,本章目录,第一节 电泳原理,一、电泳的基本原理,物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子，不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移,动速度也不同，因此可使它们分离。,若将带净电荷,Q,的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：,F,引,=E Q,（,6-1,）,在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力,F,阻,F,阻,=6rV,（,6-2,）,当,F,引,=F,阻,时,EQ=6rV,V=EQ/6r,（,6-3,）,由上式可以看出,粒子的移动速度,(,泳动速度,V),与电场强度,(E),和粒子所带电荷量,(Q),成正比,而与粒子的半径,(r),及溶液的粘度,(),成反比。,二、影响电泳的外界因素,（一）电场强度,（二）溶液的,pH,值,（三）溶液的离子强度,（四）电渗作用,（五）粒子的迁移率,（六）吸附作用,第二节 常用电泳技术和电泳方法,一、电泳技术的分类,（一）根据工作原理的不同：可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。,（二）根据有无固体支持物可分为：自由电泳和支持物电泳,（三）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、,U,型管电泳、倒,V,字形电泳、毛细管电泳等。,（四）根据支持物的特点又可分为：,无阻滞支持物电泳。高密度的凝胶电泳。,（五）根据电源控制的不同，一般可分为以下,3,类：,1.,恒压电泳,;2.,恒流电泳,;3.,恒功率电泳。,（六）根据自动化程度的不同，可分为半自动和,全自动型。,（七）根据其功能的不同，可分为制备型、分析,型、转移型、浓缩型等。,（八）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉,电泳、连续纸电泳、电泳层析相结合技术等。,（九）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、,血清蛋白电泳、制备电泳、,DNA,测序电泳等。,二、电泳方法简介,（一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。,06-02,平卧式电泳槽装置示意图,将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（,100V,1000V,）进行电泳。,（二）醋酸纤维素薄膜电泳,电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、,电泳时间短、样品,用量少。因此特别,适合于病理情况下,微量异常蛋白的检测。,06-03,血清蛋白的电泳图谱,（三）凝胶电泳,由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。,它具有机械强度好、弹性大、,透明、化学稳定性高、无电渗,作用、设备简单、样品量小,(1,100g,）,、分辨率高等优点。,06-04,凝胶电泳图,（四）等电聚焦电泳,1,等电聚焦电泳过程,一种利用有,pH,值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。,06-05,净电荷与,PH,的关系曲线,将等电点不同的蛋白质混合物加入有,pH,值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的,pH,值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。,溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异 而实现分离。,06-15 稳压稳流电泳仪,F引=E Q （6-1）,06-19 血红蛋白电泳图谱,第六节 电泳技术的质量控制,其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。,目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。,电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。,（四）电渗作用,（五）双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用,2,等电聚焦电泳的特点,使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的,pH,梯度；由于,“,聚焦效应,”,，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快,;,分辨率高,;,加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点,;,适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,（五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解,质之间的空隙中移动，,实现分离。,06-06,等速电泳示意图,（六）双向凝胶电泳（二维电泳）,第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的,PI,的不同，将蛋白质进行分离。,第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状,。,胶性,PH9,中电,加解,入质,了溶,双液,PH3,加上电场后建立稳定,PH,梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因,PI,值不同，沿,PH,梯度分离开,第一向,等电聚焦,PI,逐渐降低,等电聚焦胶放在,SDS,聚丙烯酰胺凝胶上,第二向,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI,逐渐降低,06-07,双向凝胶电泳示意图,(,七）免疫电泳,免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。,第三节,常用电泳设备的基本结构及技术指标,一、常用电泳设备的基本结构,（一）电泳电源,（二）电泳槽,（三）附加装置,06-08,平卧式电泳槽装置示意图,二、电泳仪的主要技术指标,1,输出电压,8,连续工作时间,2,输出电流,9,保护措施,3,输出功率,10,显示方式,4,电压稳定度,11,定时方式,5,电流稳定度,12,电源电压,6,功率稳定度,13,电源频率,7,输出组数,14,功耗,一、毛细管电泳的相关概念,1.,电场强度（,Electric Field Strength,）,2.,电泳淌度,(Electrophoretic Mobility),3.,迁移时间（,Migration Time,）,4.,电泳速度,(Electrophoretic Velocity),5.,电渗流 （,Electroosmotic Flow,，,EOF,）,6.,焦耳热 （,Joule Heating,）,二、毛细管电泳的基本工作原理,溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异 而实现分离。,06-09,毛细管电泳仪装置示意图,三、毛细管电泳的特点,1.,高灵敏度,2.,高速度,3.,高分辨率,4.,样品少,5.,自动化程度高,6.,应用范围广,06-10,英特雷勃,全自动电泳仪,四、毛细管电泳的分离模式,（一）毛细管区带电泳,它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间,进行定性，根据电泳峰,的峰面积或峰高进行定,量分析。,06-11,毛细血管区带电泳原理图,（二）毛细管凝胶电泳,将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。,凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。,适用于分离、测定肽类、蛋白质、,DNA,类物质的分离。,（三）毛细管胶束电动色谱,(MECC),使,MECC,系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”,(,准固定相,),之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分 配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。,06-12,毛细管胶束电动色谱原理图,（四）毛细管等电聚焦电泳,不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于,0.01pH,单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。,（五）毛细管等速电泳,毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。,（六）毛细管电色谱,它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充 或在毛细管壁,上键合（或涂壁）固,定相，从而构成毛细,管色谱柱，依靠电渗,流推动流动相，携带,样品迁移，根据样品,分子的质荷比、分子,尺寸及分配系数的差,别而分离。,06-13,CEC-,加压毛细管电色谱仪,五、毛细管电泳仪的基本结构,毛细管电泳仪的结构并不复杂，主要有高压源、毛细管柱、检测器，以及两,个供毛细管两端插入而又可,和电源相连的缓冲液槽。,（一）毛细管柱,（二）检测器,（三）毛细管电泳,法的进样技术,06-14,毛细管电泳仪,六、常用各种电泳仪简介,（一）稳压稳流电泳仪,稳压稳流电泳仪是中压电泳仪。其输出电压的调节范围为,0V,600V,、输出电流为,0mA,100mA,。该机工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善的短路保护电路和过流保护电路，是目前国内中、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。,06-15,稳压稳流电泳仪,（二）全自动醋纤膜电泳仪,全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优点为自动化程度高。只需将样品、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。,（三）全自动荧光,/,可见光双系统电泳仪,全自动荧光,/,可见光双系统电泳仪为全自动电泳仪，具有荧光,/,可见光双系统，在使用荧光试剂项目如,CK,、,LD,同工酶时为全自动。只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，操作人员可离机完成实验并得到结果。,（四）全自动琼脂糖电泳仪,全自动电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂糖凝胶电泳胶片，优点为灵敏度高，可适用于低浓度蛋白检验。该仪器自动化程度较差，当电泳结束和染色脱色完成后，工作人员必须将电泳片由机器中取出。,（五）双向电泳及双向电泳,-,液相色谱,-,质谱联用,双向电泳是将样品进行电泳后，在它的直角方向再进行一次电泳。双向电泳第一向为等电聚焦，第二向为梯度,SDS,电泳。样品经过电荷与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子量等信息。这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术，已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。,（六）高效毛细管电泳及高效毛细管电泳,-,质谱联用,高效毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为推动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。高效毛细管电泳是一种迅速发展的分离技术，仪器简单、操作简便、分析速度快、分离效率高、操作模式多、开发分析方法容易、实验成本低、消耗少、应用范围极广。,（七）毛细管电泳芯片,利用毛细管电泳芯片可以进行,DNA,长度分析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片分离荧光标记的寡核苷酸，整个分离过程在,45s,之内，而芯片的长度仅为,3.8cm,。因为其可承载高电压（,2300V/cm,）并具有较小的样品体积，故有利于得到较好的分离效果。,（八）,DNA,测序系统,该系统利用凝胶毛细管的原理，将多道毛细管阵列设计，用四种不同的荧光染色标记,4,种核苷酸，在模板上合成,DNA,单链，然后在,DNA,外切酶的作用下进行碱基的连续水解和释放，用激光识别和记录释放的碱基。,06-16,DNA,测序系统,第五节 电泳仪的临床应用,一、血清蛋白电泳,新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见,5,条带，即清蛋白、,1,、,2,、,和,球蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾病进行诊断及鉴别诊断。,06-17,血清蛋白电泳图谱,二、尿蛋白电泳,临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：确定尿蛋白的来源；了解肾脏病变的严重程度（选择性蛋白尿与非选择性蛋白尿），从而有助于诊断和预后的判断。,当不能进行肾活检时,，尿蛋白电泳结果能,很好地协助临床判断,肾脏的主要损害。,06-18,尿蛋白电泳图谱,06-22 脂蛋白电泳图谱,但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子，不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移,加上电场后建立稳定PH梯度,（一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。,进行定性，根据电泳峰,06-08 平卧式电泳槽装置示意图,06-04 凝胶电泳图,将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。,上键合（或涂壁）固,只需将样品、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。,反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。,（六）吸附作用,这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术，已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。,第五节 电泳仪的临床应用,凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。,7 输出组数 14 功耗,电泳时间短、样品,第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标,三、,血红蛋白及糖化血红蛋白电泳,应用电泳法鉴别患者血液中,Hb,的类型及含量，对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。,Hb,电泳结果应根据不同年龄人群进行分析。,06-19,血红蛋白电泳图谱,四、免疫固定电泳,可对各类,Ig,及其轻链进行分型，最常用于临床常规,M,蛋白的分型与鉴定。一般用于单克隆,Ig,增殖病、单克隆,Ig,病、本周氏蛋白和游离轻链病、多组分单克隆,Ig,病、重链病、,CSF,寡克隆蛋白鉴别、多克隆,Ig,病的诊断和鉴别诊断。,06-20,免疫固定电泳图谱,五、同工酶电泳,同工酶电泳用于临床上常见的同工酶或同工酶亚型分析。,1,乳酸脱氢酶,(LD/LDH),同工酶：,2,肌酸激酶（,CK,）同工酶：,3,CK,同工酶亚型：,06-21,同工酶电泳图谱,六、脂蛋白电泳,脂蛋白电泳检测各种脂蛋白（包括胆固醇和甘油三酯）主要用于高脂血症的分型、冠心病危险性估计，以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗（包括治疗性生活方式改变、饮食及调脂药物冶疗）效果观察的研究等。,06-22,脂蛋白电泳图谱,第六节 电泳技术的质量控制,一、电泳分析前的质量控制,（一）标本的采集与保存,（二）电泳分析的选择,（三）电泳试剂的保存,二、电泳分析中的质量控制,三、电泳分析后的质量控制,再见！,