第2章--原料预处理技术-1.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第,2,章 原材料预处理技术,2.1,、材料的选择,2.2,、细胞破碎,2.3,、抽提,2.4,、离心分离,2.5,、透析和超滤,2.1,材料的选择,一、材料的选择,1),目标物的分布与含量变化,2),实验材料的来源,1),、目标物的分布与含量变化,（,1),细胞器中的酶分布,（,2,）生物体不同组织中酶的含量,（,3,）生物体不同发育期酶含量的变化,（,4,）生物组织不同加工处理阶段生物分子的变化,（,5,）不同产地生物体活性分子的差异,分布于细胞溶质的酶,类 别,酶,参与,糖代,谢的,酶,酵解酶系,糖元合成酶、二磷酸果糖酶，磷酸化酶激酶、蛋白激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶,磷酸戊糖途径酶系,苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸裂合酶、,1-,磷酸葡萄糖尿苷酸转移酶,参与脂代谢的酶,脂肪酸合成酶复合体，乙酰辅酶,A,羧化酶、,3-,磷酸甘油脱氢酶,参与氨基酸、蛋白质代谢的酶,天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、氨基酰,-tRNA,合成酶,参与核酸合成的酶,核苷激酶、核苷酸澈酶,分布于内质网的酶,定位区域,酶,光滑内质网,胆固醇合成酶系、固醇羟基化酶系，（,C16-C24,）脂肪酸碳链延长酶糸、肉毒碱酰基转移酶。磷酸甘油酰基转移酶。药物代谢酶系,(,芳环羟化、侧链氧化、脱氨、脱烷基、脱卤等反应,),粗糙内质网,细胞质一侧,蛋白质合成酶系、三磷酸腺苷酶、,5,-,核苷酸酶；细胞色素,b5,还原酶，,NADP,细胞色素还原酶,GDP,甘露糖,-D,甘露糖基转移酶、胆固醇酰基转移酶,粗糙内质网,内腔侧,磷酸核苷酶,6-,磷酸葡萄糖酶，,6-D-,葡萄糖酸酶、,UDP-,葡糖苷酰基转移酶,分布于线粒体的酶,定位区域,酶,外 膜,酰基辅酶,A,合成酶、甘油磷酸酰基转移酶 磷酸胆碱转移酶、,NADH,脱氢酶、细胞色素,5b,还原酶、单胺氧化酶狗尿酸原羟化酶、磷脂酶,A,，腺苷酸激酶、己糖激酶,膜间腔,核苷激酶，腺苷酸激酶、,L-,木酮糖还原酶,内 膜,NADH,脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、,3-,羟丁酸脱氢酶，,3-,磷酸甘油脱氢酶、细胞色索,c,氧化酶，,ATP,酶、已糖激酶肉毒碱软脂酰转移酶,基 质,三羧酸循环酶系、脂肪酸,氧化酶系、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶，丙酗酸羧化酶谷氨酸脱氢酶,分布于溶酶体的酶,类 别,酶,水解蛋白质的酶,织织蛋白酶 弹性蛋白酶、胶原蛋白酶,水解糖苷类的酶,葡萄糖醛酸苷酶、,-,半乳糖苷酶，,甘露糖苷酶、,-N-,乙酰氨基葡糖苷酶、葡聚糖酶 透明质酸酶、溶菌酶、神经氨糖酸苷酶,水解核酸的酶,核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶,水解脂类的酶,磷脂酶,A,、胆固醇酯酶,其它水解酶,酸性磷酸酯酶、芳基硫酸酯酶,（,2,）生物体不同组织中酶的含量,（,3,）生物体不同发育期酶含量的变化,（,4,）生物组织不同加工处理阶段生物分子的变化,新鲜植物,晒干,煮汤,（,5,）不同产地生物体活性分子的差异,橘生南国为橘，,生北国则为枳！,2),、实验材料的来源,（动、植物,、,微生物）,动物器官与组织,植物器官与组织,细胞培养产物,微生物发酵培养产物,动物器官与组织,动物脏器制药所用的动物器官与组织，如猪、牛、羊等,动物的肝脏、胰腺、脑下垂体、脑组织,以及鸡,胚胎,等，其他低等或高等动物包括,海洋生物的器官与组织,均含有丰富的药物成分。,转基因动物体内外源药物基因表达产物富集的特定器官与组织，特别是,乳汁,等体液或分泌液等。,转基因技术的发展将使人类有可能把珍贵的蛋白质药物基因转移到诸如奶牛、奶羊体内，使目的蛋白质在乳腺内表达并随乳汁分泌出来，这样的转基因动物将成为活的、可饲养的生物药物,“,矿藏,”,。,植物器官与组织,如,植物的根、茎、叶、果实与种子,等。除植物器官和组织中固有的药用成分外，已可以用转基因技术将所需药物成分的编码基因转入植物，这样的转基因植物将成为活的、可种植的生物药物,“,矿藏,”,。,通过种植收获转基因植物即可获得大量有保障的、以传统方式很难获得的珍惜药物原料。,细胞培养产物,允许用于生产药用成分的哺乳动物传代细胞,有人胚肺二倍体细胞,(2BS,细胞,),、,中国仓鼠卵巢细胞,(CHO,细胞,),以及,非洲绿猴肾细胞,(Vero,细胞等,),，,原代地鼠肾细胞、鸡胚成纤维细胞,等用于乙脑、痘苗等疫苗的生产已有较长的历史，这些动物细胞作为基因工程药物的重组宿主细胞已得到广泛应用，有着广阔的应用基础与前景。,微生物发酵培养产物,以,重组酿酒酵母,为宿主系统制造药品的技术已较为成熟，酿酒酵母细胞的基因组全序列已于,1996,年破译。经遗传工程技术改造的甲基营养型,毕赤酵母和汉逊酵母,具有培养基成分简单和外源基因高表达的良好工艺性能，在生物制药领域中异军突起。,细菌,发酵培养产物,如大肠杆菌,是应用最为广泛最为成熟的基因工程药物的重组细菌宿主细胞系统。,二、材料的选择原则,有效成分含量多、稳定性好；,来源丰富；,成本低，提取工艺简单；,有综合利用价值。,选择材料时，常会提及有效成分。,所谓有效成分是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质,。,有效成分以外的其他物质则统称杂质。,在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少,，如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。,此外，,有效成分稳定性较差,，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。,三、材料的处理,选择到合适的材料后，应及时使用，否则所需的有效成分会被破坏，从而影响收得率,。,如，从猪肠黏膜提取肝素时，如果用新鲜材料，每公斤小肠可得肝素钠,5-6,万单位；如将材料置,25,以上的室温存放约,1h,，肝素钠的含量会显著下降。这是猪小肠内的大量微生物，不停地繁殖,(,如大肠杆菌约,20,分钟繁殖,1,次,),，会产生降解肝素的酶系。,1,）、动物脏器,冰冻,从刚宰杀之牲畜得到的脏器（脑组织、心脏等,）要迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，该物不仅容易氧化酸败，导致原料变质，还会影响纯化操作和制品得率。冲洗干净，绞碎后在适当的溶剂中提取。若不马上抽提、纯化，应在很短时间内置,-10,冰库,(,短期保存,),或,-70,低温冰箱,(,数月不变质,),贮存。,去除脂肪的方法见,书,P4,干燥,对于像脑下垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水、干燥后磨粉贮存备用；对于含耐高温有效成分,(,如肝素,),的肠黏膜、可在沸水中蒸煮处理，烘后能长期保存。,2,）植物组织,若是叶片，用水洗净即可使用，或在,10h,内置,-4,-30,冰箱贮藏备用；若是植物种子，则需泡胀或粉碎才可使用，如材料含油脂较多时，也要进行去壳后脱脂处理。,3,）微生物,微生物具有种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易等优点，是制备生命大分子物质的主要材料之一。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。,以微生物为材料时有两种情况：,（,1,）利用微生物菌体分泌到培养基中的,代谢产物,和胞外酶等；,这种情况下用离心法收集到的上清液，即可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分。可置低温下短时间贮存。,（,2,）利用,菌体含有的生化物质,，如蛋白质、核酸和胞内酶等。,这种情况下菌体细胞须先破碎处理才可提取有效成分，可以收集清洗菌体，制成冻干粉，在,4,保存或将菌体冻于,-20,保存。,